應(yīng)用酵母雙雜交技術(shù)分析BRD7與人類DNA復(fù)制起始蛋白的相互作用.pdf

1、在真核細(xì)胞中，DNA 的復(fù)制被嚴(yán)格的調(diào)控，以確保遺傳物質(zhì)傳遞的保真性。DNA 復(fù)制起始的控制機(jī)制確保了 DNA 在一個(gè)細(xì)胞周期中只能被復(fù)制一次，使 DNA 的合成被嚴(yán)格地控制在 S 期。目前已被發(fā)現(xiàn)的人類 DNA 復(fù)制起始蛋白大約有20個(gè)。AD24蛋白是釀酒酵母Noc3在人類的同源蛋白，參與了人類細(xì)胞的DNA復(fù)制的起始。通過(guò)酵母雙雜交等方法，可以篩選到更多與復(fù)制起始相關(guān)的蛋白。BRD7 便是通過(guò)這一方法，從人類卵巢上皮細(xì)胞cDNA文庫(kù)中

2、篩選到的與AD24相互作用的蛋白。本文通過(guò)酵母雙雜交系統(tǒng)，觀察BRD7與其他人類復(fù)制起始蛋白的相互作用，進(jìn)一步驗(yàn)證BRD7確實(shí)與DNA復(fù)制起始相關(guān)。 在本文的酵母雙雜交系統(tǒng)中，BRD7基因首先與帶有GAL4轉(zhuǎn)錄激活域(AD)的pACT2質(zhì)粒融合，構(gòu)建成“獵物”(prey)，AD24等14種人類復(fù)制起始蛋白則與帶有GAL4 DNA結(jié)合域 (BD) 的pGBKT7質(zhì)粒融合而成為“誘餌”(bait)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)除了 AD24 外，還有

3、 ORC1，ORC4，ORC5和MCM2這四個(gè)蛋白與BRD7有相互作用。隨后，本文還將BRD7基因構(gòu)建到pGBKT7質(zhì)粒上成為“誘餌”(bait)，觀察其與作為“獵物”(prey)的上述5個(gè)蛋白的相互作用。 為了進(jìn)一步了解 BRD7 與這些蛋白相互作用的細(xì)節(jié)，本文還構(gòu)建了含有 BRD7分段片斷的 pGADT7 融合質(zhì)粒作為“獵物”(prey)，與這5個(gè)蛋白進(jìn)行酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)，從而確定究竟是BRD7的哪一部分參與到了與這些蛋白的