海地瓜蛋白水解物中ace抑制肽的分離純化及合成

1、V01332012年2月高等學(xué)校化學(xué)學(xué)報(bào)CHEMICALJOURNAL0FCHINESEUNIVERSnlESNo2308_312海地瓜蛋白水解物中ACE抑制肽的分離純化及合成趙元暉1，李八方1，馬敬軍2，董士遠(yuǎn)1，劉尊英1，曾名滂1(1中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，青島266003；2中國(guó)檢驗(yàn)認(rèn)證集團(tuán)山東有限公司，青島266071)摘要采用sephadexG25凝膠柱層析、sPsephadexc25陽(yáng)離子交換層析和反相高效液相色譜等

2、方法對(duì)海地瓜水解產(chǎn)物進(jìn)行分離純化，得到了一種新的強(qiáng)活性AcE抑制肽，其氨基酸序列為MEGAQEAQGD，lC∞值為159斗moL／L采用逐步縮合和片段縮合的方法對(duì)該抑制肽進(jìn)行了設(shè)計(jì)合成合成肽的純度為9972％，分子量與序列結(jié)構(gòu)均與理論值相符研究發(fā)現(xiàn)，抑制肽與胃蛋白酶和糜蛋白酶水解反應(yīng)后，活性增強(qiáng)了35倍動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，劑量為3斗moL／kg的抑制肽對(duì)大鼠自發(fā)性高血壓具有明顯的降壓效果關(guān)鍵詞海地瓜；ACE抑制肽；分離純化中圖分類號(hào)062

3、972文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼AD0l：103969／jissn0251聊90201202017海地瓜(Aco以iM啪咖口砒矗勉Semper)俗稱香參，也稱為海茄子，盛產(chǎn)于亞熱帶沙質(zhì)海區(qū)，在日本、菲律賓、印度尼西亞及我國(guó)山東到海南島的海域均有分布，資源豐富海地瓜含有豐富的氨基酸和有益于人體的多種微量元素及維生素，這為進(jìn)一步開發(fā)利用海地瓜資源提供了一定的科學(xué)依據(jù)目前，我國(guó)的高血壓病發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，已成為僅次于腫瘤的第二大疾病，不僅嚴(yán)重威脅人們的生

4、命安全，而且嚴(yán)重影響我國(guó)社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展這就要求人們不僅要有高效的治療藥物，還要從預(yù)防高血壓做起’2J目前已有不少有關(guān)酶解食物蛋白制備具有AcE抑制活性肽的研究報(bào)道【3。J來(lái)自于純天然食物蛋白質(zhì)的ACE抑制肽對(duì)正常血壓無(wú)影響并且安全可靠∞娟J本文利用凝膠柱層析、陽(yáng)離子交換層析、反相高效液相色譜等純化技術(shù)從海地瓜蛋白酶解物中分離出具有高活性的ACE抑制肽，應(yīng)用納升電噴霧四極桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜(NanoESI—Ms／Ms)技術(shù)，對(duì)活性肽進(jìn)行結(jié)

5、構(gòu)鑒定，并采用逐步縮合和片段縮合相結(jié)合的方法對(duì)該肽進(jìn)行了設(shè)計(jì)合成這不僅可以提高海地瓜的綜合利用價(jià)值，還可以通過對(duì)降壓機(jī)理及肽結(jié)構(gòu)的深入研究為提取或合成高血壓治療藥物提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)1實(shí)驗(yàn)部分11試劑與儀器海地瓜購(gòu)于青島市天橋綜合超市，冷凍制品，濕重平均每只25g，去除內(nèi)臟洗凈備用；雄性自發(fā)性高血壓大鼠(SHR，SPF)，每只280一300g，購(gòu)于上海斯萊克斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司；馬尿酰組氨酰亮氨酸、菠蘿蛋白酶、ACE酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶和糜蛋

6、白酶為sigrna公司產(chǎn)品；Alcalase24L酶(丹麥諾維信公司)；SPsephadexc25和sephadexG25(Ph鋤acia公司)；氨基酸BocMetOH，F(xiàn)moc—Glu(OtBu)一OH，Boc—Gly—OH，H—AlaOBzlToSH，F(xiàn)mocGln(Tn)一OH和H—Asp(OBzl)2ToSH，縮合劑DCC，EDC，HOAt和HOBt以及縛酸劑NMM均購(gòu)自上海吉爾生化公司高效液相色譜儀(美國(guó)A舀lent公司)；J

7、NMECP600核磁共振譜儀(日本JEOL公司)；Nexus670型傅里葉變換紅外／拉曼光譜儀(美國(guó)Nicolet公司)；HP：5890HP：597lA色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國(guó)惠普公司)收稿日期：2011拋23基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金(批準(zhǔn)號(hào)：31000830)和山東省自然科學(xué)基金(批準(zhǔn)號(hào)：zR20locQ001)資助聯(lián)系人簡(jiǎn)介：曾名滂，男，博士，教授，主要從事水產(chǎn)品高值化利用研究Email：lIIingyz@mailouceducn趙元

8、暉，男，博士，講師，主要從事海洋生物活性物質(zhì)研究E一刪lil：zIl∞yllmhui@o∽educn萬(wàn)方數(shù)據(jù)310高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報(bào)V0133制率最大，收集峰c并濃縮，測(cè)得其Ic∞值為00934mg／mL雖然5個(gè)峰已被凝膠柱完全分開，但每個(gè)峰并不是單一物質(zhì)對(duì)峰c組分進(jìn)一步采用SPSephadexC_25陽(yáng)離子交換柱分離純化，得到7個(gè)肽峰[圖1(B)]，其中第6個(gè)肽峰(Ⅵ)顯示出最強(qiáng)的ACE抑制活性，其IC∞值為005mg／mL脫鹽后的峰Ⅵ

9、采用反相高效液相色譜C。。半制備柱繼續(xù)純化，得到活性肽P[圖l(C)]，其IC，o值為00165，∥mIF鈀1PuriIjcati帆pm腳鶴ofACEinhibitorypep蜘e(A)sepllad既G彩eluti冊(cè)p越le；(B)SPsephad既C25elutioIlprofile；(C)RPHPLcpro‰鯽a趾b艤C18唧i—p呻colu咖22ACE抑制肽結(jié)構(gòu)的鑒定采用納升電噴霧四極桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜(N鋤。一EsI—Ms／M

10、s)對(duì)純化肽P進(jìn)行分析，經(jīng)M聃seq軟件確認(rèn)該肽的結(jié)構(gòu)為MEGAQEAQGD(圖2)，精確分子量為10345444經(jīng)換算，其Ic50值為159斗moL／Lcheung等21研究了蝮蛇毒液肽及其類似物的構(gòu)效關(guān)系，認(rèn)為肽C末端為酸性氨基酸時(shí)，與ACE的親和力最弱事實(shí)上，在AcE中有2個(gè)活性位點(diǎn)，使其具有廣泛的底物和競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑【l3’“J一些c末端為酸性氨基酸的ACE抑制肽已被報(bào)道，如IVVE【151(IC卯蘭3153斗moL／L)，IAE

11、【b]1000：M一一E一G__A一—Q—一E一A一一Q一。G—D一1)M奴0兮3t獸；離藿；瓣磊小|萋；|孱i_∞葛a葛陵萎蠶琶9N氣～l^L“■‘I11002003004005006007008009()o1000mzng2Seq仳n∞pmmeofp晌edfbctionP(IC50=347斗moL／L)和MRWRD‘163(IC50=21斗moL／L)23合成肽的分析鑒定7采用反相高效液相色譜c。。分析柱測(cè)得終產(chǎn)物十肽的純度為997

12、2％純化后的十肽經(jīng)質(zhì)譜分析，[MH]10354，同位素分子量為10365，計(jì)算其分子量為10344(圖3)，序列結(jié)構(gòu)為MEGAQEAQGD(圖4)，均與理論值相符畸魯啦心8N7’蠶葷辛基ItII。200400600800100012001400mz1ig3Ma齬sp∞t咖ofsyn伍esizedd唧p僦Ienei仰毗塒么10354d髑i囂naled∞amolecularc日l(shuí)i帆(MH)mlz№4Ms／淞spectnImofsynnle