灰蓋鬼傘菌蓋多糖水解酶的分離純化、鑒定及生理功能研究.pdf

1、真菌多糖水解酶的研究有很多報道，其中很多水解酶都參與了其菌絲或子實體的自溶。對于自溶已經有了深入的認識，從最初認為的是在惡劣環(huán)境條件下細胞死亡的過程，到現在普遍認為的有著精密復雜調控機制的具有重要生理功能的過程，對真菌的生存、孢子形成和傳播等都有重要意義。但關于真菌自溶的機理還需要更加深入的研究。擔子菌特別是其中的傘菌，在子實體成熟后都有快速的自溶現象，所以我們以一種模式真菌灰蓋鬼傘為研究對象，從其中多糖水解酶對細胞壁結構的水解作用角度

2、，闡釋真菌自溶的機理。
　　本文以灰蓋鬼傘為研究材料，用硫酸銨鹽析、陰陽離子交換層析、高效液相色譜層析的方法，從灰蓋鬼傘菌蓋中分離純化出一系列具有β-1，3-葡聚糖酶活性的葡聚糖酶和一個外切幾丁質酶。質譜分析鑒定結果表明，這幾種葡聚糖酶分別為胞外β-糖苷酶、外切-β-1，3-葡聚糖酶、葡聚糖β-1，3-糖苷酶和糖苷家族16蛋白，然而經過底物特異性和作用方式分析結果顯示，它們實際分別為β-糖苷酶、β-1，3-糖苷酶、外切-β-1，3

3、-葡聚糖酶和內切-β-1，3-葡聚糖酶。底物特異性結果表明胞外β-糖苷酶不是專一的β-1，3-糖苷水解酶，對β-1，3/1，4/1，6糖苷鍵都能水解。用薄層層析色譜方法分析三種β-1，3-糖苷水解酶與昆布多糖的水解產物，結果表明這三種β-1，3-糖苷水解酶發(fā)揮協(xié)同水解作用:內切-β-1，3-葡聚糖酶昆布多糖內部的糖苷鍵產生各種長度的β-1，3-寡糖，外切-β-1，3-葡聚糖酶再將較長鏈的寡糖水解為短鏈的二糖、昆布二糖和龍膽二糖，最后β-

4、1，3-糖苷酶水解昆布二糖產生葡萄糖。殘留的龍膽二糖還需要其它β-1，6-糖苷酶來水解，胞外β-糖苷酶可能就在此發(fā)揮水解作用。因此，我們推測在灰蓋鬼傘子實體自溶過程中β-1，3-糖苷酶、外切-β-1，3-葡聚糖酶和內切-β-1，3-葡聚糖酶協(xié)同作用降解細胞壁的β-1，3-葡聚糖骨架。此外，這三種β-1，3-糖苷水解酶的最適pH和最適溫度都相同，分別為5.0和60℃，說明它們可能在相同的條件下工作，也從側面支持了上述協(xié)同作用的推測。同時從

5、灰蓋鬼傘菌蓋中用硫酸銨鹽析和弱陽離子交換色譜層析的方法，分離純化得到的一種具有幾丁質酶活性的蛋白，經過質譜鑒定為V型幾丁質酶ChiB1。底物特異性和離子色譜層析分析表明ChiB1為一種外切幾丁質酶。ChiB1的最適pH為5.0，最適溫度為35-40℃，以膠態(tài)幾丁質為底物的Km和Vmax分別為2.63mg ml-1和2.31μmol min-1 mg。ChiB1水解灰蓋鬼傘堿不溶細胞壁多糖的產物中含有大量的可溶性β-葡聚糖，因此，我們認為

6、幾丁質酶ChiB1通過水解細胞壁多糖中的幾丁質鏈從而暴露出大量的β-1，3或β-1，6葡聚糖非還原末端或者直接釋放出β-1，3或β-1，6葡聚糖分子，與β-葡聚糖酶協(xié)同作用降解細胞壁促進菌蓋的自溶，在子實體自溶中具有重要意義。通過對灰蓋鬼傘子實體葡聚糖酶和幾丁質酶生理功能的研究，我們認為葡聚糖酶和幾丁質酶都參與子實體的自溶，外切幾丁質酶ChiB1（可能還有其他幾丁質酶，如自溶中同樣高表達的Ⅲ類幾丁質酶）水解細胞壁的幾丁質結構，暴露出更多