抗CXCR3-B單克隆抗體的制備及其抗腫瘤機(jī)制的研究.pdf

1、CXCR3—B分子屬于G蛋白偶聯(lián)受體家族成員，全長(zhǎng)由415個(gè)氨基酸構(gòu)成，是目前發(fā)現(xiàn)的唯一在NH2端含ELR序列的CXC家族受體。鑒于ELR序列與血管增生密切相關(guān)，推斷ELR序列在CXCR3—B分子功能方面具有特殊的意義，因此研究CXCR3—B分子N端51個(gè)氨基酸的功能將不僅為CXC家族在血管增生效應(yīng)方面的研究提供新的思路，而且在解釋PF4及其它CXC家族無(wú)ELF序列趨化因子抑制腫瘤增生的作用機(jī)理方面也有可能會(huì)有重大突破。 本實(shí)驗(yàn)

2、主要制備了鼠/兔抗人CXCR3—B分子N端不同多肽的單/多克隆抗體，并對(duì)PF4抑制U937細(xì)胞增殖的作用機(jī)理進(jìn)行了初步研究。首先，用化學(xué)方法合成CXCR3—B分子N端第1～19個(gè)、第17～35個(gè)氨基酸和第33～51個(gè)氨基酸；同時(shí)利用RT—PCR結(jié)合PCR克隆CXCR3—B基因，測(cè)序正確后，與PGEM—T表達(dá)載體鏈接，轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行融合蛋白的表達(dá)，取裂解后的GST—CXCR3—B融合蛋白表達(dá)菌體的上清用GSTrapFFTM純化

3、柱純化，另取一部分上清用80ul（IU/ul）的Factor Xa剪切；隨后用獲得的人CXCR3—B分子N端1—51個(gè)氨基酸多肽融合蛋白免疫Balb/c小鼠，ELISA法檢測(cè)抗血清效價(jià)及篩選陽(yáng)性克隆用于細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)，以期獲得兔/鼠抗人CXCR3—B分子N端多肽多/單克隆抗體。Western blot與免疫組化鑒定后，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)初步研究抗CXCR3—B抗體在PF4抑制腫瘤轉(zhuǎn)移方面的作用機(jī)制。結(jié)果顯示：化學(xué)法合成的CXCR3—B分子N端

4、多肽抗原純度分別可達(dá)98％、88.54％和80％，可用來(lái)作為抗原免疫動(dòng)物；融合蛋白表達(dá)后SDS—PAGE分析顯示，目的蛋白在上清中表達(dá)，且Western blot表明抗CXCR3—B抗體可識(shí)別GST—CXCR3—B融合蛋白，說(shuō)明此融合蛋白已獲得正確表達(dá)；經(jīng)Factor Xa剪切后Western blot分析發(fā)現(xiàn)剪切下來(lái)的CXCR3—B可被抗CXCR3—B的多抗識(shí)別，可用于抗CXCR3—B單克隆抗體的篩選。免疫小鼠后篩選出效價(jià)高的小鼠進(jìn)行