骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)糖尿病大鼠的腎臟保護(hù)作用及其相關(guān)機(jī)制研究.pdf

1、研究背景與研究目的
　　糖尿病腎病(DN)是慢性腎臟病的最常見的病因之一，在糖尿病患者中有較高的發(fā)病率和病死率。目前的治療手段主要是嚴(yán)格的控制血糖和血壓，但這些治療手段只能延緩但不能消除DN的發(fā)生和發(fā)展。因此，尋找能延緩甚至阻斷DN進(jìn)展的新的治療策略是十分有必要的。
　　越來越多的研究表明慢性炎癥在促進(jìn)DN的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用，巨噬細(xì)胞是介導(dǎo)腎臟炎癥的關(guān)鍵炎癥細(xì)胞。已有研究發(fā)現(xiàn)在糖尿病動(dòng)物和糖尿病患者的腎組織中，巨

2、噬細(xì)胞的聚集明顯增加，并且與腎損傷的進(jìn)展和腎功能的下降程度相關(guān)。更重要的是，一些實(shí)驗(yàn)研究已經(jīng)表明，可以直接或間接抑制巨噬細(xì)胞浸潤的不同的治療策略都可以有效的防止或改善糖尿病的腎臟損傷。以上證據(jù)均表明巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的腎損傷在DN的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。
　　氧化應(yīng)激是DN的又一重要的發(fā)病機(jī)制，它是由機(jī)體活性氧(ROS)成分產(chǎn)生增加而導(dǎo)致的與抗氧化系統(tǒng)之間平衡失調(diào)引起的一系列的適應(yīng)性反應(yīng)。發(fā)生氧化應(yīng)激時(shí)，重要的大分子包括蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、碳

3、水化合物和DNA均發(fā)生氧化。糖是ROS產(chǎn)生的主要原料，高糖可以誘導(dǎo)腎小球系膜細(xì)胞產(chǎn)生ROS，上調(diào)TGF-β和細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)蛋白的表達(dá)。外源性H2O2或者由葡萄糖氧化酶連續(xù)催化產(chǎn)生的H2O2也可以上調(diào)系膜細(xì)胞中TGF-β和FN的表達(dá)。因此，控制血糖是減少氧化應(yīng)激的主要干預(yù)措施之一。此外，糖尿病時(shí)腎臟細(xì)胞的糖攝取增多導(dǎo)致了細(xì)胞內(nèi)的糖水平升高，從而引起ROS產(chǎn)生增加，ROS進(jìn)一步活化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和轉(zhuǎn)錄因子，進(jìn)而導(dǎo)致參與腎小球系膜擴(kuò)張和腎

4、小管纖維化的基因與蛋白表達(dá)上調(diào)。所以，除了嚴(yán)格控制血糖外，降低糖尿病腎臟細(xì)胞ROS產(chǎn)生的另一措施即是增加腎臟易感細(xì)胞在高糖環(huán)境下減少細(xì)胞內(nèi)糖攝取的能力。一些研究也已表明，減少GLUT膜定位，特別是GLUT1的膜定位的干預(yù)措施可以改善實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的DN。
　　大量研究都已表明間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)治療可以降低血糖，減少尿蛋白，改善腎小球損傷，但具體機(jī)制尚不明確。MSCs具有免疫調(diào)節(jié)功能，它可以抑制T細(xì)胞增殖，影響DC細(xì)胞的成熟和功能，

5、抑制B細(xì)胞的增殖和終末分化等。研究表明MSC作為免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞在一系列疾病中均發(fā)揮著重要的作用。而且越來越多的研究發(fā)現(xiàn)MSC對(duì)巨噬細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用是MSC改善炎癥相關(guān)疾病，如傷口愈合、敗血癥、急性心肌梗塞和腎缺血再灌注損傷的主要機(jī)制之一。然而，對(duì)在DN的進(jìn)展過程中的MSC與巨噬細(xì)胞的相互關(guān)系卻了解甚少。MSCs可以持續(xù)的表達(dá)SOD1，SOD2，CAT，GPX1酶和高水平的谷胱甘肽，具有有效地清除過氧化物和過氧亞硝基陰離子的能力，因此對(duì)R

6、OS和活性氮產(chǎn)物的有害作用具有低敏感性。Salmon等人研究還發(fā)現(xiàn)MSCs具有解毒活性物質(zhì)和防止蛋白組及基因組遭遇氧化損傷的酶機(jī)制。因此，MSCs被賦予了有效應(yīng)對(duì)氧化應(yīng)激反應(yīng)的主要分子機(jī)制。但是，有關(guān)MSCs能否改善糖尿病腎臟的氧化應(yīng)激反應(yīng)及相關(guān)機(jī)制的研究卻十分稀少。
　　依據(jù)上述背景，本研究以鏈脲佐菌素(STZ)一次性腹腔內(nèi)注射建立的糖尿病大鼠為模型，以MSCs尾靜脈注射來探討MSCs對(duì)糖尿病腎臟中巨噬細(xì)胞浸潤的作用及對(duì)氧化應(yīng)激

7、的影響，并在體外培養(yǎng)腎小球系膜細(xì)胞，與MSCs進(jìn)行共培養(yǎng)，進(jìn)一步探討MSCs影響糖尿病腎臟氧化應(yīng)激的機(jī)制。
　　研究方法
　　1.為明確MSCs對(duì)糖尿病腎組織中巨噬細(xì)胞浸潤的作用，體外分離培養(yǎng)鑒定大鼠骨髓來源的MSCs并用綠色熒光蛋白(GFP)進(jìn)行體外標(biāo)記，STZ一次性腹腔內(nèi)注射建立糖尿病大鼠模型，STZ注射后8周，MSCs連續(xù)2周經(jīng)尾靜脈注射，并同時(shí)設(shè)立正常對(duì)照組與疾病對(duì)照組，治療后8周，留取大鼠的血尿及腎組織進(jìn)行各指標(biāo)的

8、檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)室方法檢測(cè)各組大鼠的血糖、24h尿蛋白、肌酐清除率及腎肥大指數(shù);PAS染色檢測(cè)大鼠腎小球纖維化情況;免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)大鼠腎組織中FN、CollagenⅠ、ED-1、MCP-1的表達(dá);實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR和ELISA法分別檢測(cè)腎組織中炎癥因子IL-1β、IL-6、TNFα和HGF的基因水平和蛋白水平的表達(dá)。
　　2.為明確MSCs對(duì)糖尿病腎組織中氧化應(yīng)激的作用及相關(guān)作用機(jī)制，體外分離培養(yǎng)鑒定大鼠骨髓來源的MSC并

9、用GFP進(jìn)行體外標(biāo)記，STZ一次性腹腔內(nèi)注射建立糖尿病大鼠模型，STZ注射后8周，MSCs連續(xù)2周經(jīng)尾靜脈注射，并設(shè)立正常對(duì)照組與疾病對(duì)照組，同時(shí)有胰島素和普羅布考(PB)治療大鼠作為對(duì)照，治療后8周，留取各組大鼠的血尿及腎組織進(jìn)行各指標(biāo)的檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)室方法檢測(cè)各組大鼠的血糖、24h尿蛋白、肌酐清除率及腎肥大指數(shù);PAS染色檢測(cè)大鼠腎小球纖維化情況;免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)大鼠腎組織中FN、CollagenⅠ、TGF-β、GFP的表達(dá);實(shí)時(shí)

10、熒光定量RT-PCR法檢測(cè)腎組織中TGF-β基因水平的表達(dá);westernblot方法檢測(cè)各組大鼠腎組織中FN、CollagenⅠ、TGF-β和GLUT1的表達(dá);硫代巴比妥酸法和黃嘌呤氧化酶法分別檢測(cè)腎皮質(zhì)勻漿中MDA的含量和SOD的活性;化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)腎冰凍切片上的ROS的表達(dá)。體外培養(yǎng)腎小球系膜細(xì)胞(GMC)并進(jìn)行分組如下:GMC;GMC與MSC共培養(yǎng);培養(yǎng)于MSC培養(yǎng)基(MSC-CM)的GMC，各組均用高糖進(jìn)行刺激，刺激結(jié)束后，檢

11、測(cè)各組系膜細(xì)胞中DHE的表達(dá)，westernblot方法檢測(cè)各組系膜細(xì)胞中TGF-β和GLUT1的表達(dá);為了評(píng)估HGF對(duì)系膜細(xì)胞中高糖誘導(dǎo)的TGF-β表達(dá)的作用和活性氧產(chǎn)生的影響，MSC-CM和新鮮培養(yǎng)基與或者不與HGF中和抗體孵育1h后用于GMC的培養(yǎng)，高糖刺激后westernblot方法檢測(cè)TGF-β的表達(dá)，化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)DHE;為了評(píng)估HGF對(duì)系膜細(xì)胞中TGF-β誘導(dǎo)的GLUT1的表達(dá)，MSC-CM和新鮮培養(yǎng)基與或者不與HGF中和

12、抗體孵育后用于GMC的培養(yǎng)，TGF-β刺激后，westernblot方法檢測(cè)GLUT1的表達(dá)。
　　研究結(jié)果
　　1.MSCs通過抑制巨噬細(xì)胞的浸潤改善糖尿病大鼠腎小球的纖維化
　　1.1大鼠骨髓MSCs的形態(tài)學(xué)觀察與鑒定
　　大鼠骨髓來源的MSCs具有典型的成纖維細(xì)胞形態(tài)，貼壁生長，在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)環(huán)境下可以向成脂肪細(xì)胞和成骨細(xì)胞分化，表達(dá)CD29，CD90，CD44，不表達(dá)CD34，CD45，CD11b。

13、　　1.2MSCs腎臟內(nèi)示蹤
　　MSCsGFP移植后24h，在腎小球及附近的血管可以觀察到少量的MSCsGFP，但在移植后8周，僅在腎小球中發(fā)現(xiàn)極少的MSCsGFP細(xì)胞。
　　1.3MSCs改善糖尿病大鼠的生理生化指標(biāo)
　　較DN組相比，MSCs治療后血糖水平、24h尿蛋白水平及血清肌酐清除率均明顯下降，腎肥大指數(shù)也有所降低。
　　1.4MSCs改善腎小球纖維化，降低細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的表達(dá)
　　PAS染色顯

14、示DN組大鼠的腎臟表現(xiàn)為系膜區(qū)明顯的細(xì)胞外基質(zhì)沉積，MSCs治療明顯改善了這些病理異常。免疫組織化學(xué)染色顯示MSC組大鼠腎臟中FN和CollagenⅠ的表達(dá)較DN組明顯降低。
　　1.5MSCs對(duì)腎臟MCP-1表達(dá)和巨噬細(xì)胞浸潤的作用
　　DN組大鼠腎臟中MCP-1的表達(dá)較正常對(duì)照組明顯升高，但MSCs治療后明顯下降。STZ注射后16周，糖尿病大鼠腎臟腎小球中發(fā)現(xiàn)有ED-1細(xì)胞（表示巨噬細(xì)胞）的浸潤，與DN組相比，MSCs治

15、療明顯抑制了腎小球中巨噬細(xì)胞的浸潤。
　　1.6MSCs對(duì)HGF表達(dá)的作用
　　ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，MSCs培養(yǎng)基中分泌有大量的HGF因子，在糖尿病大鼠腎組織中，HGF的mRNA和蛋白水平的表達(dá)較正常對(duì)照組均是明顯升高的，MSC組的升高較DN組更加明顯。
　　1.7MSCs對(duì)炎癥因子的作用
　　實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR和ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，MSC組大鼠腎組織中IL-1β，IL-6，TNFα在基因水平和蛋白水平的表

16、達(dá)均較DN組明顯下降。
　　2.MSCs通過抑制腎組織中氧化應(yīng)激改善糖尿病大鼠腎小球的纖維化
　　2.1MSCs改善糖尿病大鼠的血糖和腎功能
　　STZ注射后，糖尿病大鼠的血糖明顯升高，但MSC組及Ins組大鼠血糖明顯低于DN組及PB組;與DN組相比，PB組，Ins組和MSC組的24h尿蛋白排泄率及血清肌酐清除率水平明顯下降;MSCs治療后，腎肥大指數(shù)水平明顯低于其他糖尿病大鼠組。
　　2.2MSCs改善腎小球纖

17、維化，降低細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的表達(dá)
　　PAS染色顯示DN組大鼠的腎臟表現(xiàn)為系膜區(qū)明顯的細(xì)胞外基質(zhì)沉積，腎小球硬化(GS)水平較正常組明顯升高，但PB、Ins和MSCs治療后，GS水平明顯降低，MSC組的GS水平較PB組和Ins組更為降低。免疫組織化學(xué)染色和westernblot結(jié)果顯示PB組、Ins組和MSC組中的CollagenⅠ和FN的表達(dá)較DN組明顯降低，MSC組較PB組和Ins組更為降低。
　　2.3MSCs改善糖尿病

18、腎組織和腎小球系膜細(xì)胞的氧化應(yīng)激水平，下調(diào)TGF-β的表達(dá)
　　較DN組相比，MSC組腎組織中SOD活性明顯升高，MDA含量明顯下降，腎組織冰凍切片的ROS的表達(dá)明顯下降，與PB組無明顯差異，實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR，免疫組織化學(xué)染色和westernblot法均顯示MSCs治療后腎組織中TGF-βmRNA和蛋白水平的表達(dá)均明顯下降，與PB組、Ins組亦有明顯差異。DHE染色顯示MSCs共培養(yǎng)和MSC-CM培養(yǎng)的腎小球系膜細(xì)胞的活性

19、氧的產(chǎn)生明顯減少，TGF-β表達(dá)水平明顯下調(diào)。
　　2.4MSCs對(duì)GLUT1蛋白表達(dá)的作用
　　Westernblot檢測(cè)顯示MSCs共培養(yǎng)和MSC-CM培養(yǎng)的腎小球系膜細(xì)胞的GLUT1在細(xì)胞膜上的定位明顯下調(diào);MSCs治療后，糖尿病大鼠腎組織膜蛋白中GLUT1的表達(dá)明顯下調(diào)，與DN組和PB組差異明顯。
　　2.5MSCs分泌HGF，MSC-CM對(duì)高糖刺激誘導(dǎo)的TGF-β表達(dá)和活性氧產(chǎn)生及TGF-β誘導(dǎo)的GLUT1表

20、達(dá)的作用
　　ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)MSC-CM中有大量的HGF因子。Westernblot檢測(cè)顯示MSC-CM抑制高糖刺激誘導(dǎo)的TGF-β表達(dá)的上調(diào)，HGF中和抗體(HGF-Ab)阻斷了MSC-CM的抑制作用。與或者不與HGF-Ab孵育的MSC-CM對(duì)TGF-β刺激引起的GLUT1膜定位表達(dá)的增加均無抑制作用。MSC-CM抑制高糖刺激引起的活性氧產(chǎn)生增加，HGF-Ab阻斷了MSC-CM的抑制作用。
　　結(jié)論
　　1.MS

21、Cs移植對(duì)DN具有治療作用，可以降低血糖，改善腎功能。
　　2.MSCs改善糖尿病腎臟腎小球纖維化情況，減少ECM蛋白的沉積。
　　3.MSCs的作用機(jī)制與抑制巨噬細(xì)胞浸潤有關(guān)。MSCs分泌HGF抑制MCP-1的表達(dá)，從而減少巨噬細(xì)胞的浸潤，下調(diào)糖尿病腎組織中IL-1β，IL-6，TNFα的表達(dá)。
　　4.MSCs的作用機(jī)制也與抑制氧化應(yīng)激有關(guān)。MSCs通過降低血糖和減少GLUT1在細(xì)胞膜上的定位從而減少細(xì)胞內(nèi)糖攝取進(jìn)