槐角異黃酮生物轉(zhuǎn)化及其產(chǎn)物抗乳腺癌細(xì)胞活性研究.pdf

1、槐角富含糖苷型異黃酮，利用具有豐富水解酶系的食藥用真菌進(jìn)行槐角異黃酮生物轉(zhuǎn)化有可能提升異黃酮的生物活性，但該方面研究少見(jiàn)報(bào)道。鑒于此，本論文從槐角生物轉(zhuǎn)化菌株的篩選、槐角生物轉(zhuǎn)化主要產(chǎn)物結(jié)構(gòu)解析及生物轉(zhuǎn)化工藝、轉(zhuǎn)化產(chǎn)物——染料木素溶解度的測(cè)定及關(guān)聯(lián)以及槐角發(fā)酵轉(zhuǎn)化產(chǎn)物對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖及凋亡的研究等方面重點(diǎn)研究了槐角異黃酮食藥用真菌生物轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的抗乳腺癌活性，旨在為槐角異黃酮的生物轉(zhuǎn)化及抗乳腺癌藥物的發(fā)現(xiàn)提供理論及技術(shù)基礎(chǔ)。獲得的主

2、要結(jié)果如下：
　　 通過(guò)平板透明圈法借助創(chuàng)新性的菌株布局圖分析對(duì)30個(gè)屬61株食藥用真菌的槐角生物轉(zhuǎn)化菌株進(jìn)行初篩得到18株菌株；通過(guò)固體和液體篩選培養(yǎng)基中β-葡萄糖苷酶產(chǎn)酶復(fù)篩出菌株DS1和N3，之后在槐角液體培養(yǎng)基中通過(guò)對(duì)β-葡萄糖苷酶活及槐角轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的分析，獲得槐角異黃酮有效生物轉(zhuǎn)化菌株——裂褶菌DS1（Schizophyllum commune DS1）。
　　 分別從槐角裂褶菌生物轉(zhuǎn)化2d和16d的轉(zhuǎn)化液中分離

3、純化出純度達(dá)95％的兩種化合物，經(jīng)LC-MS和NMR結(jié)構(gòu)鑒定分別為染料木素和異櫻黃素，染料木素和異櫻黃素裂褶菌生物轉(zhuǎn)化均為首次報(bào)道，其中異櫻黃素的生物轉(zhuǎn)化填補(bǔ)了國(guó)內(nèi)外異櫻黃素生物轉(zhuǎn)化的研究空白。
　　 對(duì)槐角染料木素裂褶菌生物轉(zhuǎn)化進(jìn)行了研究。酶法轉(zhuǎn)化研究結(jié)果顯示：通過(guò)分離純化獲得了純度較高的β-葡萄糖苷酶，其酶學(xué)性質(zhì)為：分子量約為43.4kDa，在50℃以下具有較好的熱穩(wěn)定性，最適溫度為50℃，最適pH為5～6，以pNPG為底物

4、測(cè)得酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km＝9.43 mmol/L，Vmax＝3.39 mmol/(L.min)；裂褶菌粗酶液酶解槐角浸膏優(yōu)化工藝為：酶用量0.3U，酶解4 h，酶解溫度50℃，酶解初始pH 5.0，Ca2+濃度30 mmol/L，槐角浸膏濃度80 g/L，染料木素轉(zhuǎn)化率達(dá)到（8.68±0.65）％（g/g）?；苯侨玖夏舅亓疡蘧l(fā)酵轉(zhuǎn)化優(yōu)化工藝為：種齡3d、二級(jí)發(fā)酵、pH自然，接種量9％、槐角底物濃度5％、轉(zhuǎn)化時(shí)間2d，染料木素轉(zhuǎn)化率達(dá)到

5、3.5mmol/L，并對(duì)染料木素發(fā)酵轉(zhuǎn)化動(dòng)力學(xué)模型進(jìn)行了研究，其動(dòng)力學(xué)模型為：
　　
　　 進(jìn)一步明晰了槐角染料木素裂褶菌發(fā)酵轉(zhuǎn)化的主要轉(zhuǎn)化途徑：槐角苷中4′-葡糖苷被水解產(chǎn)生染料木素，在轉(zhuǎn)化體系中79％染料木素的產(chǎn)生來(lái)源于槐角苷的水解。
　　 對(duì)槐角異櫻黃素裂褶菌發(fā)酵轉(zhuǎn)化進(jìn)行了初步研究。明晰了槐角裂褶菌轉(zhuǎn)化體系中異櫻黃素的主要轉(zhuǎn)化途徑：槐角苷水解形成染料木素，染料木素5-OH甲氧基化形成異櫻黃素。在優(yōu)化后的異

6、櫻黃素發(fā)酵轉(zhuǎn)化條件下，發(fā)酵12d，異櫻黃素含量達(dá)到3.4mmol/L，其轉(zhuǎn)化動(dòng)力學(xué)模型為：。
　　 利用Apelblat方程模型對(duì)染料木素在水、甲醇、乙醇、異丙醇、正丁醇和乙酸乙脂中的溶解度進(jìn)行了測(cè)定及關(guān)聯(lián)，發(fā)現(xiàn)Apelblat方程模型能較好的擬和溶解度實(shí)際數(shù)據(jù)并確定甲醇為提取染料木素溶劑。進(jìn)一步利用經(jīng)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛯?duì)染料木素在不同甲醇溶劑體系中的溶解度進(jìn)行了測(cè)定和關(guān)聯(lián)，發(fā)現(xiàn)經(jīng)驗(yàn)?zāi)Ｐ湍茌^好的擬和染料木素在不同甲醇溶劑體系中的溶解度，依據(jù)

7、該溶解度數(shù)據(jù)，確定槐角轉(zhuǎn)化液中染料木素提取溶劑為75％終濃度的甲醇溶液。
　　 槐角發(fā)酵轉(zhuǎn)化物對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖及凋亡的研究結(jié)果表明：槐角經(jīng)裂褶菌轉(zhuǎn)化后對(duì)人乳腺癌MCF-7（ER+）細(xì)胞抑制增殖作用增強(qiáng)，其抑制增殖活性物質(zhì)主要存在于乙醇提取液中；轉(zhuǎn)化主要產(chǎn)物染料木素和異櫻黃素對(duì)MCF-7細(xì)胞的抗增殖影響均具有較好的劑量和時(shí)效相關(guān)性；在低劑量和高劑量下，異櫻黃素抑制MCF-7細(xì)胞增殖活性強(qiáng)于染料木素，在10 μmol/L下二者對(duì)MC