柘樹果實抗氧化成分分析及其異黃酮Scandenolone誘導乳腺癌細胞凋亡通路研究.pdf

1、目的:
　　運用多種分離設備對柘果的抗氧化成分進行提取、分離、純化，核磁和液質聯用設備進行結構鑒定，得到柘果中的化合物。從細胞凋亡通路著手，分析異黃酮Scandenolone對乳腺癌細胞M231的抑制機理。通過一系列的研究，從而得到柘果的指紋圖譜，進一步得到柘果的藥用價值及其相應的作用機制。
　　方法:
　　(1)首先通過乙醇浸提柘樹果實，然后進行大孔樹脂和十八烷基硅烷鍵合硅膠(ODS)分離柱柱分離，最后運用制備液相設

2、備得到柘樹果實中的抗氧化成分單體，用液質聯用儀和核磁等手段進行單體結構的確定。
　　(2) MTT檢測異黃酮Scandenolone對M231細胞生長影響;原子力顯微鏡(atomicforce microscopy，AFM)觀察異黃酮Scandenolone對M231細胞形態(tài)的影響;流式細胞術（flow cytometry，FCM）觀察異黃酮Scandenolone對M231細胞周期的影響;FCM觀察異黃酮Scandenolone

3、對M231細胞線粒體膜電位(mitochondrial membranepotential，MMP)的影響;熒光酶標儀檢測異黃酮Scandenolone對M231細胞活性氧(reactie oxygen species，ROS)水平影響;Western blot測定異黃酮Scandenolone對M231細胞信號通路蛋白表達的影響，蛋白包括:casepase-3，PARP，Bcl-2，Bax，Bcl-xL, Bad,(p)-p53,(p

4、)-JNK,(p)-ERK,(p)-AKT,(p)-p38, GADPH。
　　結果:
　　(1)經過大孔樹脂柱分離后，得到4部分粗提物，分別是30％-乙醇粗提物(2.8g)，50％-乙醇粗提物(4.0g)，75％-乙醇粗提物(3.7g)，95％-乙醇粗提物(0.3g)。將4部分粗提物進行抗氧化能力分析，發(fā)現75％-乙醇部分抗氧化能力最強，進一步分離純化得到13個單體，其中4個已經得到其具體結構，分別為:Arctiin，er

5、ythrivarone A，2-(3,4-dimethoxybenzyl)-3-(3-methoxy-4-hydroxybenzyl)-(c)-butyrolactone, lappaol F。
　　(2) Scandenolone可明顯的抑制乳腺癌細胞M231的生長，當用20ug/mL濃度的Scandenolone作用細胞72h后，細胞幾乎完全停止生長，選定3個濃度(10，12.5，15ug/ml)進行后續(xù)實驗;AFM結果，Sc

6、andenolone作用細胞24h后，發(fā)現隨濃度的增大，細胞形狀逐漸從菱形變?yōu)閳A形，且細胞體積逐漸縮小，并從壁上脫落。FCM結果，引起Sub-G1凋亡峰百分數急劇增加，由低濃度組(10ug/ml)的17.9％上升到高濃度組(15ug/ml)的99.3％，同對照組比所有作用濃度均有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)，而在Scandenolone作用下，G0/G1，S和G2/M峰沒受多大影響，且隨著藥物濃度的增加，線粒體膜電位下降。熒光酶標儀檢測結

7、果，隨著藥物濃度增加，ROS含量會升高，當處理時間為30min時，ROS含量上升到最大，隨后趨于穩(wěn)定。western blot結果，不同濃度Scandenoloneon作用M231細胞24 h后，各刺激組casepase-3表達量降低，并且給藥組同對照組相比都具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，PARP表達量也明顯降低，給藥組同對照組比都具有統(tǒng)計學意義(P＜0.001);隨著Scandenolone劑量的增加，在總的p53蛋白水平變化不大(

8、P＞0.05)，而p53的磷酸化增加，給藥組同同對照組比都具有統(tǒng)計學意義(P＜0.001);上調Bax和Bcl-2的表達，但是Bax/Bcl-2的比值隨著Scandenolone的濃度增加而呈劑量效應的下降(P＜0.001)，而對Bad、Bcl-xl蛋白的表達無顯著影響;隨著Scandenoloneon劑量的增加，在總的p38 MAPKs蛋白水平保持不變的情況下(P＞0.05)，而p38 MAPKs的磷酸化水平隨劑量的增加而增加，給藥組

9、同同對照組比具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，除低劑量組（0.5ug/ml）例外。而AKT，ERK，JNK三個激酶磷酸化水平基本沒變。
　　結論:
　　(1)得到4個化合物的結構，它們是Arctiin，erythrivarone A，2-(3,4-dimethoxybenzyl)-3-(3-methoxy-4-hydroxybenzyl)-(c)-butyrolactone, lappaol F。
　　(2) Scand