豆粕異黃酮酶法提取及生物轉(zhuǎn)化的研究.pdf

1、大豆異黃酮是一類具有重要生理功能的植物雌激素,從豆粕中提取大豆異黃酮具有重要的經(jīng)濟(jì)意義.本論文對(duì)豆粕異黃酮的酶法提取及結(jié)構(gòu)修飾進(jìn)行了研究,主要結(jié)果如下: 建立了能夠同時(shí)快速檢出糖苷型和苷元型異黃酮的高效液相色譜(HPKC)法:檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm,柱溫40℃,流速1.0mL.min<'-1>,流動(dòng)相為溶劑A(10﹪乙腈,含0.1﹪三氯乙酸)和溶劑B(90﹪乙腈,含0.1﹪三氯乙酸),流動(dòng)相梯度設(shè)置為在30min內(nèi),溶劑A從100

2、﹪下降到30﹪.該測(cè)定方法能夠在較短時(shí)間內(nèi)(<20min),準(zhǔn)確地分離出糖苷型和苷元型異黃酮.進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn):對(duì)于糖苷型為主的異黃酮,用HPLC法測(cè)定的總異黃酮含量是紫外分光光度法測(cè)定含量的60﹪左右;對(duì)于苷元型為主的異黃酮,用HPLC法測(cè)定的總異黃酮含量是紫外分光光度法測(cè)定含量的75﹪左右.采用薄層層析法定性檢測(cè)糖苷型和苷元型異黃酮時(shí),選用氯仿:甲醇:水=5:1:0.5作為混合溶劑系統(tǒng),展開效果較好.其中苷元型異黃酮的R<,f>值大于

3、糖苷型異黃酮.在研究大豆異黃酮的酶法反應(yīng)中,根據(jù)R<,f>值可以判斷出大豆異黃酮組分是否已由糖苷型轉(zhuǎn)變?yōu)檐赵?從而快速地判斷出大豆異黃酮結(jié)構(gòu)修飾的進(jìn)程. 采用不同酶制劑對(duì)豆粕進(jìn)行預(yù)處理,發(fā)現(xiàn)Bacillus sp ZU-4纖維素酶預(yù)處理后,豆粕異黃酮的提取得率比常規(guī)方法提高了40﹪;黑曲霉(Aspergillus nigerZU-7)纖維素酶預(yù)處理后,大豆異黃酮的提取得率雖然沒有改變,但能把以糖苷型為主的異黃酮轉(zhuǎn)變?yōu)檐赵蜑橹?/p>

4、的異黃酮;里氏木霉(Trichoderma reeseiZU-5)纖維素酶預(yù)處理能使大豆異黃酮的提取得率提高60﹪,并能把糖苷型異黃酮轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂懈呱砘钚缘能赵彤慄S酮;木聚糖酶(200IU/g豆粕)預(yù)處理能使大豆異黃酮的提取得率提高67﹪;纖維素酶和木聚糖酶協(xié)同作用有利于提高豆粕異黃酮的提取得率,當(dāng)每克豆粕的纖維素酶用量為5FPIU、木聚糖酶為100IU時(shí),處理36h,異黃酮提取得率可提高72﹪. 對(duì)黑曲霉菌株(Asperg

5、illus nigerZU-7)固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化.采用海藻酸鈣包埋黑曲霉孢子使β-葡萄糖苷酶得到有效的固定.固定化β-葡萄糖苷酶可專一性地切除糖苷型豆粕異黃酮的葡萄糖基,形成生理活性更高的苷元型異黃酮.在重復(fù)分批反應(yīng)條件下,連續(xù)7批的苷元型異黃酮得率均可保持在90﹪以上.采用連續(xù)反應(yīng)工藝,當(dāng)稀釋率為0.12 h<'-1>時(shí),苷元型異黃酮得率可達(dá)95﹪. 確定了提取豆粕中苷元型異黃酮的適宜工藝參數(shù)為:乙

6、醇濃度為80﹪,料液比為1:5,提取溫度為50℃,提取時(shí)間為4h,大豆異黃酮的提取率為0.31﹪.采用逆流萃取工藝,在逆流萃取5次的條件下,可以使異黃酮的提取得率從單次的0.31﹪提高到0.37﹪.采用攪拌回流法優(yōu)于浸提法. 極性大孔樹脂SD200適合于糖苷型異黃酮的精制,其適宜作用條件為:上柱液濃度為0.5 mg/mt,上柱量為7個(gè)樹脂床體積(BV),上柱液pH為4,上柱吸附流速為1.0 mg/mL,;洗脫條件:用80﹪乙醇作

7、為洗脫劑,解吸流速為2mL,/min.精制后糖苷型異黃酮純度可達(dá)53﹪.弱極性大孔樹脂HZ801適合于苷元型異黃酮的精制,適宜作用條件為:上柱液濃度為0.5 mg/mL,上柱量為6BV,上柱液pH為3-4,上柱吸附流速為1.0 mg/mL;洗脫條件:用95﹪乙醇作為洗脫劑,解吸流速為2.5mL,/min.精制后苷元型異黃酮純度可達(dá)55﹪. 本論文在豆粕異黃酮的酶法提取、利用固定化β-葡萄糖菅酶對(duì)糖苷型異黃酮進(jìn)行定向修飾、以及針對(duì)