線粒體DNA突變相關(guān)的耳聾分子機(jī)制的研究.pdf

1、耳聾是人類(lèi)最常見(jiàn)的殘疾之一，這種疾病嚴(yán)重的影響著人類(lèi)的生活、交流乃至社會(huì)生產(chǎn)力。世界衛(wèi)生組織估計(jì)，全世界有2.5億人患有中度以上聽(tīng)力損失，中國(guó)有聽(tīng)力語(yǔ)言障礙的殘疾人約2057萬(wàn)，而其中由于線粒體DNA的突變導(dǎo)致的耳聾約占5‰，如果按照這個(gè)比例計(jì)算，全世界大約有125萬(wàn)耳聾患者的耳聾是由于線粒體的病變所引起，而在我國(guó)這個(gè)人數(shù)大約是102850人，因此對(duì)線粒體相關(guān)性耳聾進(jìn)行研究，不僅是人類(lèi)認(rèn)識(shí)自然和改造自然的一個(gè)重要方面，而且還具有重大的社

2、會(huì)意義和經(jīng)濟(jì)意義。本研究的主要目的是探討與線粒體DNA突變有關(guān)的耳聾的分子機(jī)制，以期為將來(lái)預(yù)防和治療線粒體性耳聾提供一定的理論依據(jù)和思路。研究表明，導(dǎo)致耳聾的線粒體DNA突變主要有點(diǎn)突變和大片段重組，為了比較全面的研究線粒體相關(guān)性耳聾的分子機(jī)制，我的研究主要包括以下幾個(gè)部分： 第一章遺傳性耳聾患者臨床資料的收集為了對(duì)遺傳性耳聾特別是由于線粒體DNA突變導(dǎo)致的耳聾進(jìn)行其發(fā)病的分子機(jī)制的研究，我們首先在解放軍總醫(yī)院耳鼻咽喉科門(mén)診收集

3、各種遺傳性耳聾患者的臨床資料。在收集資料之前，我們制定了各種標(biāo)準(zhǔn)如：患者的入選標(biāo)準(zhǔn)和排除標(biāo)準(zhǔn)，各種聽(tīng)力檢測(cè)儀器的校準(zhǔn)和聽(tīng)力測(cè)定的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)；患者聽(tīng)力損失分級(jí)的標(biāo)準(zhǔn)等等。此項(xiàng)工作同時(shí)也是解放軍總醫(yī)院耳鼻咽喉科與美國(guó)辛辛那提大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)院人類(lèi)遺傳實(shí)驗(yàn)室的合作項(xiàng)目的一部分。在2003年3月-2004年1月期間，我們?cè)诠彩占?88個(gè)患者的病例資料，除患者本人外，還收集168位家屬血樣，總共582管，其中在全部患者中有藥物性耳聾34例。然

4、后我們對(duì)從所有收集的患者血樣中提取的基因組DNA進(jìn)行線粒體12SrRNA基因突變的篩查。共查出7例A1555G突變、3例T1095C突變和1例Kearns-Sayre綜合征的患者，我們第二、第三部分的工作就在這些患者的資料基礎(chǔ)上展開(kāi)。 第二章線粒體基因突變導(dǎo)致的非綜合征型耳聾的分子機(jī)制研究由線粒體基因突變而導(dǎo)致的耳聾主要有兩種形式：非綜合征型耳聾和綜合征型耳聾。在這一部分中，我們研究了幾個(gè)攜帶A1555G突變的家系的分子遺傳學(xué)特

5、征，這幾個(gè)家系的表現(xiàn)型都比較特殊——他們的耳聾的外顯率都很低(分別是5.2％，4.8％，4.2％和13.3％，平均8％)，常常在一個(gè)家族中只有1個(gè)或者2個(gè)耳聾患者，而其他母系親屬，雖然也攜帶A1555G突變，但是卻并不表現(xiàn)出耳聾。序列分析表明，這些家系的線粒體DNA除攜帶A1555G突變以外，都顯示出一種獨(dú)特的多態(tài)性。這些家系中母系成員的mtDNA單體型分別屬于不同的單體群：R9a，N9a，D4a和D4，提示A1555G突變的散發(fā)性，而

6、且在中國(guó)人的線粒體DNA的進(jìn)化過(guò)程中有所增加。然而，在這幾個(gè)患者的線粒體DNA的tRNA基因和rRNA基因中，缺乏有顯著的功能意義的突變或者繼發(fā)的導(dǎo)致Leber視神經(jīng)病的突變。這些結(jié)果提示核基因組和/或線粒體DNA的單體型在這些家系中A1555G的外顯率方面的意義可能不顯著。在這幾個(gè)家系中，氨基糖甙類(lèi)抗生素可能是A1555G突變的表現(xiàn)型的主要修飾因子。 由于有些藥物性耳聾患者并不攜帶已知的導(dǎo)致耳聾的線粒體DNA的突變，因此我們?cè)?/p>

7、分析了上述幾個(gè)家系的分子遺傳特征的同時(shí)，又著手尋找可能導(dǎo)致耳聾的線粒體DNA的新突變。結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)了三例攜帶T1095C突變的耳聾患者。序列分析表明這三個(gè)患者的線粒體基因組都有T1095C的突變，此外還顯示獨(dú)特的多態(tài)性。T1095C突變以前曾經(jīng)在不同的遺傳背景的家庭中被認(rèn)為與聽(tīng)覺(jué)損失有關(guān)。而且，在364個(gè)中國(guó)人的正常對(duì)照中，都沒(méi)有發(fā)現(xiàn)這個(gè)突變，T1095C在這些遺傳上不相干的有聽(tīng)力損失的家庭中出現(xiàn)強(qiáng)烈地提示這個(gè)突變是導(dǎo)致聽(tīng)力損失的致病

8、因素。在這些患者的mtDNA中有些堿基改變顯示出高度的進(jìn)化保守性。這些結(jié)果提示T1095C突變可能與氨基糖甙類(lèi)抗生素導(dǎo)致的非綜合征型的耳聾有關(guān)，而其他保守的突變可能對(duì)這些患者中耳聾的臨床表現(xiàn)型的表達(dá)貢獻(xiàn)了一部分作用。 第三章線粒體基因突變導(dǎo)致的綜合征型耳聾—-Kearns-Sayre綜合征的分子機(jī)制研究導(dǎo)致綜合征型耳聾的線粒體突變的一種主要形式是線粒體DNA的重組，包括大片段缺失和重復(fù)。在我們收集的病例中，有一例Kearns-S

9、ayre綜合征患者。這種病雖然是一種罕見(jiàn)的綜合征型耳聾，但是其線粒體DNA的變化在致病性線粒體DNA突變中卻有一定的代表性。這個(gè)家系還有一個(gè)特殊的特征，即除了先癥者患有KSS綜合征之外，該家族內(nèi)還有母系遺傳的視力缺失(先癥者本人也有同樣的視力缺失)。因此我們?cè)O(shè)想在這個(gè)家系的母系親屬中，可能有一個(gè)導(dǎo)致視力缺失的線粒體DNA突變位點(diǎn)，同時(shí)該家系的先癥者即這個(gè)KSS綜合征患者還攜帶一個(gè)新的導(dǎo)致這種罕見(jiàn)的綜合征型耳聾的線粒體DNA突變，這兩個(gè)突

10、變可能有一定的關(guān)系。我們利用longPCR、PCR、測(cè)序的方法定位了該線粒體DNA的突變——一個(gè)長(zhǎng)達(dá)9309bp的大片段缺失，這個(gè)缺失的兩個(gè)斷點(diǎn)的位置分別在nt6129和nt15437，其跨越的范圍從mtDNA的COⅠ基因的中部到Cytb基因的中部，斷點(diǎn)將COⅠ基因的中部和Cytb基因的中部連接起來(lái)。這一缺失突變涉及氧化磷酸化復(fù)合體Ⅰ(ND3、ND4L、ND4、ND5、ND6)；復(fù)合體Ⅲ的Cytb；細(xì)胞色素C氧化酶(COⅠ、COⅡ、CO