線粒體DNA4834缺失突變?cè)趦?nèi)耳擬老化模型中的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、實(shí)驗(yàn)一大鼠內(nèi)耳擬老化伴線粒體突變模型的建立
　　 目的：探討建立大鼠內(nèi)耳擬老化伴線粒體突變模型，為進(jìn)一步揭示老年性聾發(fā)病機(jī)制及其防治策略奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：Wistar大鼠24只，隨機(jī)分為2組，A組(D-半乳糖組,14只)，5[％]D-半乳糖頸部皮下注射(150mg*kg-1*d-1)，共8周，繼以生理鹽水腹腔注射10天；B組(空白對(duì)照組，10只)全程僅給予生理鹽水注射。聽(tīng)性腦干反應(yīng)(auditory brainst

2、em respones，ABR)檢測(cè)兩組大鼠反應(yīng)閾，比色法檢測(cè)兩組大鼠膜迷路谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-PX)活力。利用巢氏聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)檢測(cè)內(nèi)耳組織線粒體DNA 4834 bp缺失突變的發(fā)生情況。
　　 結(jié)果：用藥后A組大鼠線粒體DNA 4834bp缺失突變發(fā)生率為100[％](28耳/28耳),B組無(wú)線粒體DNA 4834 bp缺失突變檢出。A組GSH-PX活力(59.07±

3、2.32U)明顯低于B組(142.10±2.21U)，其差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t檢驗(yàn)，雙側(cè)檢驗(yàn)，P=0.000<0.01)。而A組ABR反應(yīng)閾平均提高5.36±3.08dB peSPL，B組為6.50±3.37dB peSPL。經(jīng)t檢驗(yàn),A組和B組之間差異無(wú)顯著性意義(t檢驗(yàn)，雙側(cè)檢驗(yàn)，pAD=0.508)。
　　 結(jié)論：D-半乳糖可以誘導(dǎo)大鼠內(nèi)耳組織擬老化，此模型大鼠內(nèi)耳組織線粒體DNA4834bp缺失突變率極高，但是ABR

4、反應(yīng)閾無(wú)明顯提高。
　　 實(shí)驗(yàn)二提取大鼠毛發(fā)核酸3種方法的比較
　　 目的：探討提取大鼠毛發(fā)核酸的方法。
　　 方法：分別用PCR緩沖液法、SDS-蛋白酶K法和Chelex-100法從大鼠毛發(fā)中提取核酸，對(duì)所提核酸進(jìn)行PCR擴(kuò)增及電泳分析，并對(duì)3種方法進(jìn)行比較。
　　 結(jié)果：從毛囊提取mtDNA的成功率，SDS-蛋白酶K法(22.50[％])分別與PCR緩沖液法(64.17[％])和Chelex-100法

5、(67.50[％])比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Pc1=42.421，Pc2=28.800,均P<0.001)；PCR緩沖液法與Chelex-100法比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Pc=0.296,P>0.05)。提取核DNA成功率，SDS-蛋白酶K法(60.00[％])分別與PCR緩沖液法(90.00[％])和Chelex-100法(90.83[％])比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Pc1=49.091，Pc2=30.767,均P<0.001)；P

6、CR緩沖液法與Chelex-100法比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Pc=0.048，P>0.05)。PCR緩沖液法不能從毛干中提取核酸，SDS-蛋白酶K法不能從1、2根鼠毛中提取mtDNA，而Chelex-100法可從毛干和單根鼠毛中提取mtDNA和DNA。
　　 結(jié)論：Chelex-100法對(duì)從毛發(fā)中提取核酸較為合適。
　　 實(shí)驗(yàn)三大鼠線粒體DNA4834bp缺失突變?cè)诓煌M織器官中的差異表現(xiàn)
　　 目的：探討在模型

7、大鼠內(nèi)耳、腎臟、大腦、血、骨骼肌、脾臟、心臟、肝臟、肺和毛發(fā)等不同的組織中，線粒體DNA4834bp缺失突變的發(fā)生情況及其可能的病理意義。同時(shí)探討毛發(fā)代替血標(biāo)本用于臨床檢測(cè)線粒體缺失突變的可行性。
　　 方法：Wistar大鼠24只，隨機(jī)分為2組，A組(D-半乳糖組,14只)，5[％]D-半乳糖頸部皮下注射(150mg*kg-1*d-1)，共8周，繼以生理鹽水腹腔注射10天；B組(空白對(duì)照組，10只)僅給予生理鹽水注射。利用巢氏

8、聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)檢測(cè)各組織線粒體DNA 4834 bp 缺失突變的發(fā)生情況。
　　 結(jié)果：用藥后A組大鼠各器官均可檢出CD，其中內(nèi)耳、顳肌、肝臟CD檢出率最高，為100[％]，腎臟和大腦次之，為92.86[％](a)，脾臟85.71[％](b)，心臟、肺臟和毛發(fā)組織為71.43[％]，血液中檢出率最低，僅為35.71[％]。其中除血液CD檢出率與內(nèi)耳CD檢出率比較，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外 (p=0.001<0.01，雙尾檢驗(yàn)，

9、Fisher's 精確概率檢驗(yàn))，其他組織和內(nèi)耳組織CD檢出率之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(pa=1.000，pb=0.481，pc=0.098，p均>0.05，雙尾檢驗(yàn)，F(xiàn)isher’s 精確概率檢驗(yàn))。而在對(duì)照組中，僅肝臟(20[％])，大腦和腎臟(10[％])檢出了CD 突變，其他組織均未檢出CD的存在。
　　 結(jié)論：提示D-半乳糖除了誘導(dǎo)大鼠內(nèi)耳4834bp 缺失突變以外，可以誘導(dǎo)模型多器官CD突變。CD缺失率高低可能與組織的

10、有絲分裂程度和氧化磷酸化活躍程度有關(guān)。同時(shí)提示毛發(fā)CD檢出率更能代表內(nèi)耳CD 缺失情況，可以代替血標(biāo)本用于臨床檢測(cè)線粒體缺失突變。
　　 實(shí)驗(yàn)四大鼠內(nèi)耳擬老化模型對(duì)氨基糖貳類抗生素耳毒性的易感性
　　 目的：研究大鼠內(nèi)耳擬老化模型對(duì)氨基糖甙類抗生素的易感性。
　　 方法：Wistar大鼠50 只，隨機(jī)分為4組，A組(半乳糖組,14 只)5[％]D-半乳糖頸部皮下注射(150mg.kg-1.d-1)，共8周，繼以生

11、理鹽水腹腔注射10天；B組(半乳糖加卡那霉素組，14只)皮下注射半乳糖同A組，8周后，腹腔注射硫酸卡那霉素(500mg.kg-1.d-1)10天。C組(卡那霉素組，12只)前8周用生理鹽水代替半乳糖，后10天卡那霉素注射同B組。D組(空白對(duì)照組，10 只)僅給予生理鹽水注射。聽(tīng)性腦干反應(yīng)(auditory brainstemrespones，ABR)檢測(cè)各組大鼠反應(yīng)閾，比色法檢測(cè)各組大鼠膜迷路谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione

12、peroxidase,GSH-PX)活力。利用巢氏聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)檢測(cè)內(nèi)耳組織線粒體DNA 4834 bp 缺失突變的發(fā)生情況。
　　 結(jié)果：用藥后A組大鼠線粒體DNA4834bp缺失突變發(fā)生率為100[％](28耳/28耳)，B組為92.86[％](26 耳/28 耳)，C組和D組均無(wú)線粒體DNA 4834 bp缺失突變檢出。A組GSH-PX活性為59.07±8.70U，B組63.29±12.40U，C組136.67±9.53

13、U，D組142.10±7.02U。A組和D組之間差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Pad=0.000)；A組和B組，C組和D組之間差異沒(méi)有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Pab=0.307，Pcd=0.151)。A組ABR反應(yīng)閾平均提高5.36±3.08 Db peSPL，B組為61.79±11.20dB peSPL，C組為34.17±4.69 Db peSPL，D組為6.50±3.37 Db peSPL。經(jīng)校正t'檢驗(yàn)，A組和D組之間差異無(wú)顯著性意義(Pad=

14、0.398)，B組和C組分別與D組之間差異有顯著性意義(Pbd=0.000，Pcd=0.000)，B組和C組之間差異也有顯著性意義(Pbc=0.000)。
　　 結(jié)論：D-半乳糖可以誘導(dǎo)大鼠內(nèi)耳組織擬老化，此模型大鼠內(nèi)耳組織mtDNA4834bp缺失突變率極高，同時(shí)對(duì)氨基糖甙類抗生素耳毒性的易感性增強(qiáng)。
　　 實(shí)驗(yàn)五核因子與mtDNA4834bp缺失突變相互作用在大鼠內(nèi)耳對(duì)氨基糖貳類藥物耳毒性易感中的作用
　　

15、目的：研究氨基糖甙類抗生素耳聾易感模型中的大鼠內(nèi)耳膜迷路中線粒體相對(duì)拷貝數(shù)，核基因編碼的核呼吸因子-1(NRF-1)、過(guò)氧化物酶增值子激活受體-γ亞單位共激活因子(PGC-1)及線粒體DNA編碼的細(xì)胞色素C氧化酶亞單位Ⅲ(COXⅢ)的Mrna水平變化，以及COXⅢ蛋白水平的變化和mtDNA4834bp缺失突變，探討核因子與mtDNA4834bp缺失突變相互作用在大鼠內(nèi)耳對(duì)氨基糖甙類藥物易感中的作用。
　　 方法：Wistar大鼠

16、16只，隨機(jī)分為2組，A組(半乳糖加卡那霉素組，10只)皮下注射半乳糖同A組，8周后，腹腔注射硫酸卡那霉素(500mg.kg-1.d-1)10天。B組(空白對(duì)照組，6只)第一階段用生理鹽水代替半乳糖注射，第二階段用藥同A組。聽(tīng)性腦干反應(yīng)(auditory brainstem respones，ABR)檢測(cè)各組大鼠反應(yīng)閾，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)(polymerase chain reaction,PCR)檢測(cè)內(nèi)耳線粒體拷貝數(shù)(copy num

17、ber,CN)，巢氏聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)(nest PCR)檢測(cè)內(nèi)耳組織線粒體DNA 4834 bp 缺失突變的發(fā)生情況,半定量的逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)(reverse transcription PCR,RT-PCR)檢測(cè)內(nèi)耳NRF-1、 PGC-1和COXⅢ的Mrna 水平，蛋白免疫印跡法(western-blot)檢測(cè)內(nèi)耳COXⅢ蛋白水平。
　　 結(jié)果：用藥后A組大鼠線粒體DNA 4834bp 缺失突變發(fā)生率為100[％]，B