豚鼠肺臟上皮細(xì)胞形態(tài)組成學(xué)及TLR信號(hào)因子的表達(dá)定位研究.pdf

1、豚鼠由于在發(fā)育、生理和免疫反應(yīng)機(jī)制等方面與人類存在諸多的相似而成為一種用于研究發(fā)育生物學(xué)和疾病的發(fā)病機(jī)制與致病機(jī)理的理想動(dòng)物模型。豚鼠對(duì)多種呼吸道病原體高度敏感，如豚鼠很容易感染結(jié)核分枝桿菌，且感染后產(chǎn)生酷似人類的進(jìn)行性肺結(jié)核病變，這使得豚鼠成為結(jié)核分枝桿菌分離、鑒別、診斷和各種抗結(jié)核病藥物和疫苗的篩選，以及致病機(jī)理研究的理想動(dòng)物模型之一。然而，相對(duì)其它實(shí)驗(yàn)動(dòng)物而言，由于缺乏有效的免疫學(xué)試劑及豚鼠肺臟細(xì)胞生物學(xué)的相關(guān)參考資料，極大限制了

2、利用豚鼠動(dòng)物模型開(kāi)展肺臟疾病的研究工作。因此，系統(tǒng)研究豚鼠呼吸道上皮細(xì)胞形態(tài)組成學(xué)及主要先天免疫調(diào)控信號(hào)通路，TLR信號(hào)在豚鼠肺臟中的表達(dá)定位，將有助于進(jìn)一步揭示豚鼠肺臟上皮的生物學(xué)特征，為研究豚鼠的肺臟先天免疫機(jī)制及其作為呼吸道疾病模型的致病機(jī)理提供理論基礎(chǔ)。為此，我們開(kāi)展了相關(guān)的研究工作，并取得以下結(jié)果：
　　 1.本項(xiàng)目通過(guò)電鏡、組織化學(xué)染色(HE、PAS等)、免疫組織化學(xué)(IHC)染色等方法對(duì)豚鼠呼吸道主要上皮細(xì)胞的類型

3、組成(基底細(xì)胞、纖毛細(xì)胞、杯狀細(xì)胞、克拉拉細(xì)胞、神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞)進(jìn)行形態(tài)學(xué)和微細(xì)結(jié)構(gòu)等細(xì)胞生物學(xué)特征的觀察。結(jié)果顯示，豚鼠肺臟上皮細(xì)胞的組成類型與特征比小鼠和人的肺臟存在更多的相似性，這表明其比小鼠更適合于人肺臟疾病動(dòng)物模型。另外，研究發(fā)現(xiàn)抗人、小鼠和/或兔源的Keratin14、Keratin18、CGRP、CCSP和Mucin5AC抗體均與豚鼠發(fā)生交叉反應(yīng)，為進(jìn)一步利用這些免疫學(xué)試劑探討豚鼠肺臟上皮細(xì)胞在先天免疫中的作用機(jī)理奠定了基

4、礎(chǔ)。
　　 2.提取新鮮豚鼠肺組織的RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA作為模板，通過(guò)反轉(zhuǎn)錄PCR的方法擴(kuò)增、克隆并鑒定了豚鼠肺臟組織中TLRs信號(hào)通路中的相關(guān)信號(hào)分子TLR1、TLR2、TLR4、TLR6、TLR7、TLR8、TLR10、MYD88和TRAF6等9種TLR信號(hào)通路因子的基因片段，并利用RT-PCR的方法檢測(cè)到它們?cè)诜闻K中均有表達(dá)；免疫組化結(jié)果顯示TLR4/2、TLR3、TLR6、TLR11、MYD88和TRAF6為染色陽(yáng)性

5、，表明這6種作用于其它品種的抗體可用于豚鼠相關(guān)信號(hào)蛋白表達(dá)的免疫組化鑒定。Realtime-qPCR的檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在普通級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物不同個(gè)體間的TLR2、TLR4、TLR7和TLR10存在表達(dá)水平的差異，且下游信號(hào)分子MYD88和TRAF6總體表達(dá)水平較高。根據(jù)免疫組化和Realtime-qPCR試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)相對(duì)表達(dá)量較高的MYD88和TLR11與肺臟上皮細(xì)胞的特異表達(dá)蛋白進(jìn)行免疫熒光雙染，準(zhǔn)確定位了它們?cè)陔嗍蠓闻K上皮細(xì)胞中的克拉拉細(xì)胞