糖尿病腎小管上皮細(xì)胞中骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7表達(dá)的信號(hào)通路調(diào)節(jié)及藥物干預(yù)研究.pdf

1、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7（Bone morphogenetic protein-7，BMP-7）是近年來(lái)備受關(guān)注的與腎臟損害密切相關(guān)的細(xì)胞因子，糖尿病腎病(Diabetic nephropathy，DN)和其它腎臟疾病時(shí)腎小管上皮細(xì)胞BMP-7活性的丟失是腎小管間質(zhì)纖維化的一個(gè)重要因素。已有研究發(fā)現(xiàn)使用外源性BMP-7可以改善腎臟纖維化病變，恢復(fù)腎功能，使已經(jīng)發(fā)生的病變逆轉(zhuǎn)。同時(shí)促進(jìn)內(nèi)源性BMP-7的表達(dá)及其調(diào)控機(jī)制的研究，也不失為一種值得探

2、索的治療方法。但是，目前對(duì)DN時(shí)內(nèi)源性BMP-7表達(dá)的調(diào)節(jié)機(jī)制研究甚少。
　　我們和其他作者的研究表明，在糖尿病狀態(tài)下，高血糖可通過(guò)蛋白激酶Cα(protein kinase Cα，PKCα)和p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen activated protein kinase，p38MAPK)信號(hào)分子及通路將高糖信息傳入細(xì)胞核，促進(jìn)TGF-β和CTGF等促纖維化因子表達(dá)增多而使細(xì)胞表型和生長(zhǎng)改變，促進(jìn)膠原、纖維連接

3、蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)合成增多、降解減少，使腎臟肥大和纖維化。由此我們推測(cè)，PKCα和p38MAPK既然介導(dǎo)了高糖促DN發(fā)病的病理信號(hào)而引起腎臟損傷，那么這些信號(hào)分子及通路可能也介導(dǎo)了糖尿病的病理信號(hào)而調(diào)節(jié)具有抗纖維化作用的BMP-7表達(dá)。然而高糖狀態(tài)下PKCα或p38MAPK是否參與BMP-7的調(diào)節(jié)的研究未見(jiàn)報(bào)道。因此本課題在第一部分動(dòng)態(tài)觀(guān)察了體內(nèi)和體外BMP-7表達(dá)的變化;第二部分分別探討了BMP-7表達(dá)減少是否受PKCα和p38MAPK

4、信號(hào)分子及通路的調(diào)節(jié)。
　　本課題組以往的研究表明含丹參和黃芪的中藥復(fù)方制劑——丹芪合劑具有活血化瘀和益氣養(yǎng)陰之功效，對(duì)糖尿病大鼠腎臟具有保護(hù)作用，但其作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。因此，本課題第三部分觀(guān)察了丹芪合劑是否通過(guò)促進(jìn)內(nèi)源性BMP-7及其受體ALK-3的表達(dá)來(lái)發(fā)揮其對(duì)腎臟的保護(hù)作用及該作用是否與PKCα或/和p38MAPK的調(diào)節(jié)有關(guān)，希望從DM腎臟病變負(fù)調(diào)節(jié)的角度為DN的防治提供前瞻性實(shí)驗(yàn)依據(jù)和思路。
　　第一部分 糖尿

5、病大鼠及高糖培養(yǎng)原代腎小管上皮細(xì)胞BMP-7表達(dá)變化的研究
　　目的:
　　動(dòng)態(tài)觀(guān)察DN大鼠不同時(shí)點(diǎn)的腎臟及高糖刺激不同時(shí)點(diǎn)的來(lái)自同種動(dòng)物原代培養(yǎng)腎小管上皮細(xì)胞BMP-7的表達(dá)，以進(jìn)一步探討高糖與腎臟BMP-7表達(dá)變化之間的關(guān)系。
　　方法:
　　體內(nèi)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型復(fù)制及分組:采用鏈脲佐菌素(STZ)55mg/kg一次性SD大鼠尾靜脈注射造模，分為2w、4w、8w、12w、16w、24w糖尿病組(DM)及各相應(yīng)時(shí)點(diǎn)

6、正常對(duì)照組(N)。
　　體外實(shí)驗(yàn)同種動(dòng)物原代腎小管上皮細(xì)胞培養(yǎng)鑒定及干預(yù)分組:正常糖（含糖5.5mM）組、高糖（含糖20mM）組和高滲（含甘露醇20mM）組，培養(yǎng)30min、2h、6h、12h、24h、48h、72h、96h和120h不同時(shí)點(diǎn)。
　　檢測(cè)方法及指標(biāo):生化方法測(cè)定大鼠血糖、24h尿蛋白、血肌酐和腎臟指數(shù)，HE和PAS染色光鏡觀(guān)察腎臟病理改變，免疫組化檢測(cè)腎組織BMP-7和FN蛋白的表達(dá)，Western blot

7、和RT-PCR分別檢測(cè)腎皮質(zhì)和培養(yǎng)細(xì)胞BMP-7蛋白和mRNA及FN mRNA的表達(dá)，免疫熒光觀(guān)察培養(yǎng)的腎小管上皮細(xì)胞BMP-7的蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　生化指標(biāo)及病理改變表明糖尿病(diabetes mellitus，DM)模型復(fù)制成功，原代培養(yǎng)之細(xì)胞鑒定為腎小管上皮細(xì)胞。體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)顯示糖尿病大鼠和原代培養(yǎng)的腎小管上皮細(xì)胞BMP-7的表達(dá)逐漸減少且mRNA水平降低早于蛋白減少，而FN的表達(dá)逐漸增多。
　　結(jié)論:

8、
　　STZ誘導(dǎo)的SD大鼠糖尿病模型和高糖培養(yǎng)的原代腎小管上皮細(xì)胞中BMP-7蛋白和mRNA的表達(dá)減少。
　　第二部分 糖尿病和高糖狀態(tài)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路對(duì)BMP-7表達(dá)的調(diào)控研究
　　目的:
　　觀(guān)察PKCα信號(hào)分子或p38MAPK信號(hào)通路對(duì)糖尿病大鼠和原代培養(yǎng)的腎小管上皮細(xì)胞BMP-7表達(dá)的影響。
　　方法:
　　體內(nèi)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型復(fù)制及分組:①方法同第一部分，分為16w和24wDM組及16wDMT和2

9、4wDMT組，其中DMT組動(dòng)物從第13w起注射胰島素控制血糖至正常范圍;設(shè)同時(shí)點(diǎn)N組。②采用STZ50mg/kg一次性大鼠尾靜脈注射造模，分為12wN組和DM組。
　　體外實(shí)驗(yàn)同種動(dòng)物原代腎小管上皮細(xì)胞干預(yù)分組:(1)正常對(duì)照組，用DMEM+2％FCS培養(yǎng);(2)高滲組，用20mM D-Mannitol+DMEM+2％FCS培養(yǎng);(3)高糖組，用20mM D-Glucose+DMEM+2％FCS培養(yǎng);(4) p38MAPK特異性抑

10、制劑SB202190+HG處理組或PKCα特異性抑制劑G(O)6976+HG處理組，用SB20219020μmol/L或G(O)69761μmol/L+DMEM預(yù)處理細(xì)胞40分鐘后棄預(yù)處理液，然后SB20219020μmol/L或G(O)69761μmol/L+20mM D-Glucose+ DMEM+2％FCS培養(yǎng);72小時(shí)后收集細(xì)胞。
　　檢測(cè)方法及指標(biāo):免疫組化檢測(cè)腎組織BMP-7、p38MAPK、p-p38MAPK、PKC

11、α、ANGⅡ、CTGF、α-SMA和FN蛋白的表達(dá)，免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)培養(yǎng)的原代腎小管上皮細(xì)胞BMP-7、PKCα、ANGⅡ、α-SMA和FN蛋白的表達(dá)，Western blot檢測(cè)培養(yǎng)的原代腎小管上皮細(xì)胞BMP-7、p38MAPK、p-p38MAPK蛋白的表達(dá)水平，RT-PCR分別檢測(cè)腎皮質(zhì)和培養(yǎng)的原代腎小管上皮細(xì)胞BMP-7、PKCα和FN mRNA水平。免疫熒光觀(guān)察培養(yǎng)的腎小管上皮細(xì)胞BMP-7的蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果:

12、　　體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示DM大鼠腎小管PKCα，p38MAPK和p-p38MAPK蛋白顯著上調(diào)，并且與BMP-7蛋白呈顯著負(fù)相關(guān)，在控制血糖后BMP-7蛋白和mRNA的表達(dá)水平顯著上調(diào)，而p-p38MAPK、PKCα、α-SMA和FN蛋白表達(dá)顯著下調(diào)。體外培養(yǎng)的原代腎小管上皮細(xì)胞使用特異性抑制劑抑制PKCα信號(hào)分子或p38MAPK信號(hào)通路后，高糖下調(diào)BMP-7被顯著抑制。
　　結(jié)論:
　　體內(nèi)外研究均表明PKCα信號(hào)分子或p38MA

13、PK信號(hào)通路可能分別參與高糖下調(diào)BMP-7表達(dá)的機(jī)制。
　　第三部分 丹芪合劑和依那普利對(duì)DM大鼠腎小管上皮細(xì)胞BMP-7表達(dá)的影響
　　目的:
　　觀(guān)察丹芪合劑和依那普利對(duì)DM大鼠腎小管上皮細(xì)胞BMP-7及其受體ALK-3、p38MAPK、PKCα、ANGⅡ和FN表達(dá)的影響，以期進(jìn)一步探討丹芪合劑防治DN的作用機(jī)制。
　　方法:
　　實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型復(fù)制及分組:我們采用第二部分②批動(dòng)物模型，在成模后丹芪合劑治

14、療組按2g/kg/d給藥，依那普利治療組按10mg/kg/d給藥，藥物碾磨摻入少量飼料中給予，連續(xù)12w。
　　檢測(cè)方法及指標(biāo):生化方法測(cè)定大鼠血糖、24h尿蛋白、血肌酐和腎臟指數(shù)，PAS染色光鏡觀(guān)察腎臟病理改變，免疫組化檢測(cè)腎組織BMP-7、PKCα、p38MAPK、ANGⅡ、CTGF和FN蛋白的表達(dá)，RT-PCR檢測(cè)腎皮質(zhì)BMP-7、ALK-3、PKCα和p38MAPK mRNA的水平。
　　結(jié)果:
　　丹芪合劑可

15、上調(diào)DM大鼠腎小管上皮細(xì)胞BMP-7及其受體ALK-3的表達(dá)，而下調(diào)PKCα、p38MAPK、ANGⅡ、CTGF和FN的表達(dá);相關(guān)性分析顯示糖尿病、丹芪合劑組腎小管上皮細(xì)胞BMP-7分別與PKCα、p38MAPK、AngⅡ和FN蛋白的表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)。而依那普利也可上調(diào)DM大鼠腎小管上皮細(xì)胞BMP-7及其受體ALK-3的表達(dá)，尤ALK-3mRNA水平高于正常對(duì)照組，除p38MAPK mRNA水平外，腎小管上皮細(xì)胞PKCα、p38MAPK

16、、ANGⅡ、CTGF和FN的表達(dá)均明顯減少，相關(guān)性分析顯示依那普利組腎小管上皮細(xì)胞BMP-7分別與PKCα、p38MAPK、AngⅡ、CTGF和FN蛋白的表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)。
　　結(jié)論:
　　丹芪合劑可能通過(guò)抑制PKCα和/或p38MAPK的活化，促進(jìn)內(nèi)源性BMP-7及其受體ALK-3表達(dá)增加，從而發(fā)揮對(duì)糖尿病大鼠腎小管間質(zhì)損傷的保護(hù)作用。依那普利在促進(jìn)內(nèi)源性BMP-7及其受體ALK-3表達(dá)的上調(diào)和改善腎功能等方面的機(jī)制可能不