FMRP對(duì)DROSHA的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控及其在脆性X綜合征發(fā)病機(jī)制中的作用.pdf

1、【目的】FXS是最常見的遺傳性智力低下疾病之一，其發(fā)病的主要原因是FMR1基因5′非翻譯區(qū)的CGG重復(fù)序列異常擴(kuò)增，導(dǎo)致FMRP的生成減少或缺失。FMRP在腦組織的表達(dá)量很高，作為一種選擇性RNA結(jié)合蛋白，F(xiàn)MRP在各種刺激的誘導(dǎo)下于轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控著一系列靶mRNA的轉(zhuǎn)運(yùn)和翻譯。FMRP對(duì)靶基因的異常調(diào)控，特別是對(duì)與突觸形成與可塑性調(diào)節(jié)相關(guān)的靶基因的異常調(diào)控，可能是FXS的分子發(fā)病機(jī)制。既往研究表明，F(xiàn)MRP通過與Dicer及AGO蛋白

2、相互作用以及與成熟miRNA相互結(jié)合，從而參與miRNA作用通路。通過miRNA芯片檢測(cè)及熒光定量PCR驗(yàn)證的方法，先前發(fā)現(xiàn)了一部分成熟miRNAs及其相應(yīng)的前體 miRNAs在 Fmr1敲除小鼠海馬組織中表達(dá)上調(diào)，而其相應(yīng)的原始miRNAs表達(dá)則基本不變，提示 FMRP可能作用于 pri-miRNA的加工過程。DROSHA酶作為一種RNase III，具有核酸內(nèi)切酶活性，DGCR8蛋白則具有雙鏈RNA結(jié)合域，可以識(shí)別并結(jié)合雙鏈 RNA

3、，兩者在細(xì)胞核內(nèi)通過相互作用形成DROSHA-DGCR8復(fù)合體，將pri-miRNA切割成pre-miRNA，在miRNA加工、成熟過程中起著關(guān)鍵性的作用。因此，推測(cè)Fmr1敲除小鼠中DROSHA和/或DGCR8的表達(dá)異常可能是導(dǎo)致miRNA表達(dá)譜改變的原因。本研究通過檢測(cè)FVB小鼠海馬組織及小鼠Neuro-2a細(xì)胞中miRNA成熟過程關(guān)鍵酶DROSHA和DGCR8的表達(dá)水平，研究FMRP對(duì)該蛋白表達(dá)的調(diào)控機(jī)理，以期揭示FMRP參與mi

4、RNA加工過程中的分子機(jī)制，為進(jìn)一步認(rèn)識(shí)FXS發(fā)病機(jī)制提供新的理論依據(jù)。
　　【方法】
　　1、提取FVB小鼠海馬組織總RNA、總蛋白及核蛋白，采用qRT-PCR、Westernblot在mRNA及蛋白水平上檢測(cè)Fmr1 WT鼠及KO鼠海馬組織中DROSHA及DGCR8的表達(dá)情況；
　　2、利用FMRP過表達(dá)及干擾表達(dá)質(zhì)粒（以及相應(yīng)對(duì)照質(zhì)粒）轉(zhuǎn)染Neuro-2a細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48小時(shí)之后根據(jù)不同目的對(duì)細(xì)胞進(jìn)行相應(yīng)處理，以分

5、析 FMRP對(duì)DROSHA表達(dá)的調(diào)控。
　?、贆z測(cè)FMRP對(duì)Drosha mRNA及蛋白水平的影響：提取上述細(xì)胞總RNA及核蛋白之后，分別進(jìn)行qRT-PCR、Western blot檢測(cè)；
　　②檢測(cè)FMRP對(duì)Drosha mRNA穩(wěn)定性的影響：采用放線菌素D處理上述細(xì)胞，處理0、3、6 hr后提取細(xì)胞總RNA后進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)；
　?、蹤z測(cè)FMRP對(duì)Drosha mRNA翻譯效率的影響：采用放線菌酮處理上述細(xì)胞

6、，裂解細(xì)胞后采用線性蔗糖梯度離心法分離多聚核糖體，通過 qRT-PCR對(duì)多聚核糖體（3個(gè)核糖體以上）結(jié)合的mRNA進(jìn)行分析；
　　3、利用FVB小鼠海馬組織以及過表達(dá)FMRP的Neuro-2a細(xì)胞進(jìn)行RNA結(jié)合蛋白免疫共沉淀（RIP）實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)FMRP與Drosha mRNA在體（in vivo）結(jié)合的情況；接著，采用FVB小鼠海馬組織漿蛋白以及純化GST融合FMRP蛋白進(jìn)行RNA電泳凝膠遷移實(shí)驗(yàn)（RNA-EMSA），進(jìn)一步尋找F

7、MRP與Drosha mRNA的具體結(jié)合序列；
　　4、構(gòu)建psiCHECK-pri-miRNA質(zhì)粒，與過表達(dá)或干擾表達(dá)FMRP質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染Neuro-2a細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 hr后利用雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)FMRP對(duì)DROSHA酶活性的影響。
　　【結(jié)果】
　　1、DROSHA蛋白水平在Fmr1 KO鼠海馬組織中較WT鼠明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而DGCR8蛋白、DroshamRNA、Dgcr8mRNA水平在Fmr1

8、KO鼠及WT鼠海馬組織中的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；
　　2、過表達(dá)FMRP后細(xì)胞DROSHA蛋白水平明顯上升，相反，干擾FMRP表達(dá)后細(xì)胞DROSHA蛋白水平明顯下降，差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，然而，過表達(dá)及干擾表達(dá)FMRP后細(xì)胞DroshamRNA水平均無明顯改變，提示FMRP在轉(zhuǎn)錄后水平上上調(diào)DROSHA表達(dá)；
　　3、與相應(yīng)的對(duì)照組相比，F(xiàn)MRP過表達(dá)與干擾表達(dá)后細(xì)胞Drosha mRNA的半衰期無明顯改變，提示FMRP不影響N

9、euro-2a細(xì)胞DroshamRNA的穩(wěn)定性；
　　4、與對(duì)照組相比，過表達(dá) FMRP后細(xì)胞多聚核糖體結(jié)合的 Drosha mRNA量明顯增多，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，證實(shí)FMRP提高Neuro-2a細(xì)胞Drosha mRNA的翻譯效率；
　　5、采用FVB小鼠海馬組織進(jìn)行RIP實(shí)驗(yàn)，結(jié)果可見Fmr1 WT鼠海馬組織中沉淀的DroshamRNA量較KO鼠明顯增多（約3倍），差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；進(jìn)一步采用Neuro-2a細(xì)胞進(jìn)行該實(shí)

10、驗(yàn)，結(jié)果顯示過表達(dá)FMRP的Neuro-2a細(xì)胞中沉淀的Drosha mRNA量較對(duì)照組明顯增多（約2倍），差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，證實(shí)了FMRP可以在體（invivo）結(jié)合DroshamRNA；
　　6、經(jīng)生物信息學(xué)分析后挑選11段Drosha RNA探針與FVB小鼠海馬組織漿蛋白進(jìn)行RNA-EMSA實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)C5、C6、C7、U1段探針存在阻滯條帶，提示可以與漿蛋白結(jié)合；但上述4段探針與Fmr1 WT鼠及KO鼠海馬組織漿蛋白結(jié)合條帶

11、的亮度無明顯差別；進(jìn)一步將上述4段探針與純化GST融合FMRP蛋白進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，則未見特異性阻滯條帶，說明本研究未能找到 Drosha mRNA與FMRP結(jié)合的具體位置；
　　7、雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)結(jié)果可見，與相應(yīng)的對(duì)照組相比，Neuro-2a細(xì)胞過表達(dá)與干擾表達(dá)FMRP后5種psiCHECK-pri-miRNA載體的熒光素酶活性（hRluc/ hluc+）均無明顯改變，說明FMRP表達(dá)水平的改變不影響DROSHA酶切割5種p