肝癌細(xì)胞在不同受體趨化劑中的趨化行為及其與整合素和細(xì)胞骨架的關(guān)系.pdf

1、趨化最初是單細(xì)胞生物某些細(xì)胞最基本最原始的運(yùn)動(dòng)形式，像變形蟲，溶組織阿米巴等靠體表任何部位形成的臨時(shí)性的細(xì)胞質(zhì)突起（偽足）作為運(yùn)動(dòng)器而運(yùn)動(dòng)。很多資料認(rèn)為：偽足的形成是由于骨架再組裝驅(qū)動(dòng)，特別是肌動(dòng)蛋白微絲骨架的重組。偽足作為一個(gè)突出的小泡出現(xiàn)在顯微鏡下，有時(shí)沿著下層基質(zhì)變的扁平（像扁平足），有時(shí)更圓或離開表面（像頭足）。從熒光顯微鏡或電子顯微鏡發(fā)現(xiàn)：這個(gè)區(qū)域總是包含有密集的F-actin微絲網(wǎng)絡(luò)和少量的微管。盡管actin微絲在偽足形成

2、時(shí)所起的作用或多或少的已被接受，人們對(duì)于產(chǎn)生推力的機(jī)理仍舊有不同的意見。涉及到推力的模型從肌動(dòng)蛋白在膜上直接起作用，到肌漿球蛋白的收縮，或可利用的凝膠滲透壓驅(qū)使F-actin微絲網(wǎng)絡(luò)凝膠化等等均被提出來說明偽足的擴(kuò)展。 本文應(yīng)用生物力學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、光鏡和電鏡技術(shù)以肝實(shí)質(zhì)癌細(xì)胞（hepatocellular carcinoma cells，HCC）為研究對(duì)象，用不同受體的趨化劑作用于肝癌細(xì)胞SMMC-7721株，通過微吸管吸吮技

3、術(shù)和Boyden小室來研究其趨化特性，觀察肝癌細(xì)胞在趨化劑IV型膠原、層粘連蛋白、組織胺作用下對(duì)細(xì)胞偽足相互作用的影響。本研究方法具有直觀、精細(xì)，易定量的特點(diǎn)；深入研究癌細(xì)胞趨化行為和分子機(jī)制，進(jìn)而防治侵襲和轉(zhuǎn)移，具有現(xiàn)實(shí)意義。 本課題的主要研究內(nèi)容及結(jié)果如下： （1）用單微吸管法研究肝癌細(xì)胞在IV型膠原（type IV collagen，Col IV）、層粘連蛋白（laminin，LN）、組織胺（Histamine）趨

4、化作用下偽足生長的動(dòng)態(tài)過程，同時(shí)考察了肝癌細(xì)胞偽足的形成分別對(duì)趨化液中ColIV、LN和組織胺濃度的依賴性。隨著ColIV趨化劑濃度的增加（100 μg/ml~400 μg/ml），HCC細(xì)胞的偽足長度增加；當(dāng)ColIV濃度≥400 μg/ml時(shí)，細(xì)胞偽足的長度基本不變。隨著LN趨化劑濃度的增加（50 μg/ml~200 μg/ml），HCC細(xì)胞的偽足長度增加；當(dāng)LN濃度≥200 μg/ml 時(shí)，細(xì)胞偽足的長度基本不變。而組織胺（0.0

5、5 ng/ml~500 ng/ml）對(duì)肝癌細(xì)胞無趨化特性。 （2）應(yīng)用雙微吸管法研究濃度不對(duì)稱趨化實(shí)驗(yàn)中雙側(cè)偽足形成的相互影響和趨化劑種類不同時(shí)趨化性偽足形成的強(qiáng)度。結(jié)果表明：一側(cè)ColIV濃度固定，另一側(cè)隨著組織胺濃度升高，細(xì)胞偽足長度逐漸降低；雙側(cè)偽足一側(cè)因組織胺趨化濃度升高而偽足生成減弱并未使另一側(cè)偽足生成增強(qiáng)。隨著組織胺濃度增加（0.5 ng/ml~50 ng/ml）組織胺濃度為0.5 ng/ml，5 ng/ml和50

6、ng/ml時(shí)，偽足的峰值長度分別為3.03±0.54 μm，0.94±0.52 μm，2.07±0.55 μm。，偽足的峰值在5 ng/ml時(shí)降到最低。另側(cè)在ColIV濃度為200 μg/ml趨化下偽足的長度跟單微吸管同樣濃度趨化作用下偽足長度無明顯差別 。 （3）用單微吸管法研究用細(xì)胞松弛素D（cytochalasin D，CD）及鈣離子（Ca2+）作用于細(xì)胞后，IV型膠原趨化作用下偽足形成的趨化過程。隨著CD濃度的增加（0.

7、5 μg/ml~2.0 μg/ml），HCC偽足長度減小，當(dāng)CD濃度為2.0 μg/ml時(shí)，細(xì)胞偽足的長度最短；隨著Ca2+濃度的增加（1 μmol/l~3.0 μmol/l），HCC偽足長度減小，當(dāng)Ca2+濃度為3.0 μmol/l時(shí)，細(xì)胞偽足不再形成。光鏡和電鏡技術(shù)顯示了細(xì)胞骨架的變化。加入2.0 μg/ml 濃度的CD和3.0 μmol/l Ca2+化后，細(xì)胞骨架的分配與未加入干擾劑的對(duì)照組相比，骨架大部分發(fā)生紊亂，小部分開始溶解

8、甚至消失。 （4）采用單微吸管研究整合素單克隆抗體Anti-CD49a~Anti-CD49d阻斷后，IV型膠原趨化作用下偽足形成的趨化過程，以證實(shí)付遍紅的結(jié)果。隨著微吸管內(nèi)Anti-CD49a和Anti-CD49d混合物濃度的增加（5 μg/ml，10 μg/ml ，20 μg/ml），HCC仍有明顯偽足形成同時(shí)與肝癌細(xì)胞未阻斷時(shí)的偽足長度相比，偽足的變化不明顯（P>0.05）。而隨著Anti-CD49b和Anti-CD49c濃

9、度的增加（0.5 μg/ml~2.0 μg/ml），在抗體濃度較低（5 μg/ml）時(shí)，仍可見有偽足形成；當(dāng)抗體濃度較高時(shí)(≥10 μg/ml)，此時(shí)與肝癌細(xì)胞經(jīng)Anti-CD49b或Anti-CD49c阻斷時(shí)偽足長度相比，偽足受到明顯的抑制（P<0.01）。 （5）采用Boyden小室來研究在Boyden小室中偽足在不同濃度的ColIV和組織胺趨化液作用下偽足的趨化遷移性。在ColIV濃度為200 μg/ml時(shí)，細(xì)胞移動(dòng)數(shù)目為

10、541.06±40，ColIV濃度為400 μg/ml，600 μg/ml時(shí)，細(xì)胞移動(dòng)數(shù)目分別為720.36±60，924.21±71。當(dāng)ColIV濃度≥600 μg/ml，細(xì)胞移動(dòng)數(shù)目基本不變；而組織胺幾乎無趨化性。然后研究細(xì)胞松弛素D和組織胺對(duì)群體細(xì)胞在ColIV趨化下的遷移運(yùn)動(dòng)的影響。用細(xì)胞松弛素D作用于HCC后，隨著濃度的增大（0.5 μg/ml~2.0 μg/ml），細(xì)胞移動(dòng)的數(shù)目逐漸減少，對(duì)其的遷移運(yùn)動(dòng)的抑制較控制組顯著（p

11、<0.01）。而組織胺作用于細(xì)胞后，細(xì)胞移動(dòng)數(shù)目減少，當(dāng)組織胺濃度為10-10,10-9 ,10-8,10-7 mol/L時(shí)，細(xì)胞移動(dòng)數(shù)目分別是939.2±41，831.1±52，521.2±89，648.9±75，細(xì)胞遷移性降低，在組織胺濃度為10-8 mol/L時(shí)細(xì)胞移動(dòng)數(shù)目最低，與控制組相比，差異顯著（p<0.01）。 從實(shí)驗(yàn)的結(jié)果可以得到以下幾個(gè)結(jié)論： （1）當(dāng)單微吸管內(nèi)加入不同濃度的Col IV和LN趨化劑，H

12、CC細(xì)胞向趨化液中的偽足生長呈現(xiàn)明顯的濃度依賴性，和一定的濃度飽和性。當(dāng)細(xì)胞在400 μg/ml Col IV和200 μg/ml LN趨化作用下，其偽足形成達(dá)到飽和狀態(tài)，說明趨化液配體與細(xì)胞膜上受體結(jié)合分子數(shù)達(dá)到飽和；而組織胺0.05 ng/ml~500 ng/ml對(duì)肝癌細(xì)胞無趨化性。當(dāng)微吸管兩側(cè)對(duì)于不同濃度的趨化劑，HCC細(xì)胞向ColIV和組織胺中偽足的長度隨著組織胺濃度的升高而縮短，在組織胺濃度為5.0 ng/ml，偽足長度最小，

13、抑制顯著，而組織胺側(cè)偽足的縮短并未對(duì)另側(cè)細(xì)胞偽足的形成造成明顯的影響。 （2） 當(dāng)細(xì)胞骨架干擾劑細(xì)胞松弛素D和鈣離子于ColIV趨化劑作用下，細(xì)胞松弛素D的濃度為0.5 μg/ml~2 μg/ml時(shí)，Ca2+濃度為1μmol/l~3.0μmol/l時(shí)，細(xì)胞偽足的生長與控制組相比抑制顯著（P<0.01），并具有濃度依賴性。及光鏡和電鏡下骨架的紊亂無序及溶解，說明細(xì)胞骨架干擾劑通過引起胞內(nèi)微絲骨架的解聚而抑制偽足的形成，即細(xì)胞骨架是

14、形成偽足的原動(dòng)力。 （3） 整合素單抗Anti-CD49a~Anti-CD49d處理細(xì)胞后，Anti- CD49b、Anti- CD49c(10 μg/ml ，20 μg/ml)對(duì)肝癌細(xì)胞在IV型膠原趨化運(yùn)動(dòng)時(shí)偽足的生長與單個(gè)單抗作用相比有較強(qiáng)的抑制作用（P<0.01），表明α2 、α3是IV型膠原的效應(yīng)受體。 （4） 在Boyden小室中偽足在不同濃度的ColIV趨化液作用下呈現(xiàn)明顯的趨化遷移性；細(xì)胞松弛素D則主要通過