CTGF-整合素ανβ5受體信號途徑在PASMC增殖、遷移、細(xì)胞骨架改變和細(xì)胞外基質(zhì)基因表達(dá)中的作用.pdf

1、目的:1、探討整合素αvβ5在CTGF促進(jìn)PASMC增殖、遷移、細(xì)胞骨架變化和細(xì)胞外基質(zhì)沉積中的作用。2、明確細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK1／2)信號通路是否參與了CTGF-整合素αvβ5信號途徑所致PASMC上述生物學(xué)行為改變的過程。3、初步探討CTGF－整合素αvβ5受體信號途徑在肺動(dòng)脈高壓肺血管重構(gòu)中的作用。
　　 方法:1.體外培養(yǎng)SD大鼠PASMC,并用a－SMA免疫組化染色鑒定細(xì)胞純度。將實(shí)驗(yàn)分為空白組、CTGF(50

2、ng／ml)組、CTGF(50ng／ml)+整合素αvβ5單克隆抗體P1F6組。2、WST-1檢測不同時(shí)間點(diǎn)及不同濃度P1F6對CTGF促進(jìn)PASMC增殖的影響,找出最佳干預(yù)時(shí)間點(diǎn)及最佳干預(yù)濃度。3、采用Transwell小室檢測P1F6對CTGF促進(jìn)PASMC遷移的影響。4、采用考馬斯亮藍(lán)R250染色觀察CTGF、CTGF+P1F6對細(xì)胞骨架改變的影響；并用激光共聚焦顯微鏡技術(shù)檢測FAK表達(dá)的變化。5、實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測CT

3、GF、P1F6對CollagenⅠ-α1、CollagenⅢ-α1、Fibronectin-1 mRNA表達(dá)的影響。6、采用Western—blot檢測P1F6、CTGF對CollagenⅢ、ERK1／2、p-ERK1／2蛋白表達(dá)的變化。
　　 結(jié)果:1、免疫組化染色顯示,a-SMA染色陽性細(xì)胞大于95％,表明其為PASMC。2、用CTGF(50ng／ml)和0、5、10、15μg／ml整合素αvβ5抗體P1F6分別刺激PASM

4、C0h、24h、48h、72h和96h,WST-1檢測結(jié)果表明,整合素αvβ5抗體對CTGF促進(jìn)PASMC增殖有明顯抑制作用。其中P1F6為10μg／ml72h時(shí)抑制率為25.6％,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；P1F6為15μg／ml72h時(shí)抑制率為35％,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。由此求出整合素αvβ5抗體最佳干預(yù)濃度為15μg／ml,最佳刺激時(shí)間為72h。3、Transwell小室檢測結(jié)果顯示,P1F6(10μg／ml

5、)作用PASMC24h后,CTGF促進(jìn)PASMC遷移受到明顯抑制(P<0.001)。4、考馬斯亮藍(lán)R250染色觀察細(xì)胞骨架變化結(jié)果發(fā)現(xiàn)24h時(shí),各組之間細(xì)胞骨架變化不明顯；在12h時(shí)與對照組比較,CTGF組能短暫改變細(xì)胞形態(tài),使細(xì)胞骨架模糊不清；加入P1F6后,CTGF所引起的細(xì)胞形態(tài)變化不明顯。用激光共聚焦顯微鏡觀察P1F6、CTGF作用下PASMC中FAK表達(dá)變化,結(jié)果顯示CTGF組于對照組相比,12h及24h細(xì)胞胞質(zhì)皺縮,細(xì)胞形態(tài)

6、變小,FAK形成均顯著減少,其中以24h變化最明顯。加入P1F6封閉整合素αvβ5后,與CTGF組比較上述變化不明顯,但FAK形成較對照組仍有減少,其中以24h最明顯。5、RT-PCR檢測結(jié)果顯示,與對照組比較,CTGF作用于PASMC72h,CTGF能顯著促進(jìn)CollagenⅠ-α、CollagenⅢ-α1、Fibronectin-1 mRNA表達(dá)(P<0.05)；使用P1F6后與CTGF組比較三種基因mRNA表達(dá)均減少(P<0.05

7、),但均較對照組表達(dá)增加。6、蛋白質(zhì)印跡檢測結(jié)果表明,CTGF作用于PASMC72h,與對照組比較CTGF明顯促進(jìn)CollagenⅢ蛋白表達(dá)(P<0.05)；應(yīng)用P1F6后CollagenⅢ蛋白表達(dá)較CTGF組減少(P<0.05),但較對照組表達(dá)增加。用Western-blot檢測P1F6、CTGF作用PASMC72h后ERK1／2磷酸化水平,結(jié)果提示CTGF作用PASMC72h后ERK1／2磷酸化程度增加,加入P1F6封閉整合素αvβ