p32在EGF誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞趨化運(yùn)動和轉(zhuǎn)移中的作用.pdf

1、研究背景和目的:
　　 乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一。腫瘤轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的基本生物學(xué)特征，是腫瘤復(fù)發(fā)、治療失敗和死亡的主要原因，因此尋找與乳腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的分子靶點(diǎn)，糾正和改善其惡性生物學(xué)行為，起著越來越重要的作用。文獻(xiàn)報(bào)道，p32在甲狀腺癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、胃癌、食管癌以及肺腺癌組織中高表達(dá)[1]，另外，在乳腺癌中，p32 mRNA含量增高，p32 mRNA的表達(dá)量與乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)[2]，但其具體機(jī)制尚不明確。

2、　　 本研究第一部分運(yùn)用免疫組化的方法探討了p32在乳腺癌組織中的表達(dá)，以及與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系，尤其是p32與腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)系。本研究第二部分中，進(jìn)一步利用小RNA干擾技術(shù)降低p32在乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)水平，在細(xì)胞水平探討p32降表達(dá)對EGF誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞趨化運(yùn)動和轉(zhuǎn)移的影響，并研究p32在腫瘤細(xì)胞運(yùn)動和轉(zhuǎn)移中的相關(guān)分子機(jī)制，以闡明p32蛋白與乳腺癌細(xì)胞運(yùn)動和轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系，最后運(yùn)用細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)建立p32降表達(dá)乳腺癌細(xì)胞系和小鼠實(shí)

3、驗(yàn)轉(zhuǎn)移模型探討p32對乳腺癌細(xì)胞在體內(nèi)轉(zhuǎn)移的影響。深化對腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移分子機(jī)制的認(rèn)識，為臨床腫瘤抗轉(zhuǎn)移治療提供新的思路和靶點(diǎn)。
　　 研究方法:
　　 1)免疫組化方法檢測p32在人乳腺癌組織和乳腺小葉增生組織中的表達(dá)，分析p32的表達(dá)與腫瘤轉(zhuǎn)移等臨床病理參數(shù)的相關(guān)性。
　　 2)應(yīng)用Western blot的方法檢測不同乳腺癌細(xì)胞系中的p32表達(dá)水平，并用免疫熒光染色的方法和細(xì)胞成分分離的方法檢測p32在細(xì)胞內(nèi)的

4、定位。
　　 3) MTT實(shí)驗(yàn)和軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)，探討運(yùn)用小RNA干擾技術(shù)降表達(dá)后p32對MDA-MB-231細(xì)胞的增殖的影響。
　　 4)趨化運(yùn)動實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)，探討運(yùn)用小RNA干擾技術(shù)降表達(dá)p32后對乳腺癌細(xì)胞運(yùn)動能力的影響。
　　 5) P32在細(xì)胞的氧化磷酸化中起重要作用，采用線粒體有氧呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ抑制劑Rotenone檢測其在細(xì)胞運(yùn)動中的作用，探討氧化磷酸化在細(xì)胞運(yùn)動中的作用。
　　 6)構(gòu)

5、建p32過表達(dá)質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)染入HEK293細(xì)胞中，做質(zhì)譜分析，尋找與p32相互作用蛋白，從而深入探討p32影響細(xì)胞運(yùn)動的分子機(jī)理。質(zhì)譜分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PKCζ是p32的相互作用蛋白之一，再用免疫共沉淀的方法驗(yàn)證二者之間是否存在相互作用。
　　 7)采用PKCζ的磷酸化特異性抗體檢測p32降表達(dá)對EGF刺激后PKCζ的磷酸化水平的影響，同時用免疫熒光的方法檢測p32對PKCζ膜轉(zhuǎn)位的影響及降表達(dá)PKCζ，觀察PKCζ對p32定位的影響

6、。
　　 8)分別構(gòu)建p32和PKCζ不同片段的載體，明確p32與PKCζ的結(jié)合部位，進(jìn)一步探討p32與PKCζ之間的調(diào)控關(guān)系。并用不同片段的p32載體對降表達(dá)細(xì)胞進(jìn)行拯救，探討p32在運(yùn)動中起作用的結(jié)構(gòu)域。
　　 9)劃痕實(shí)驗(yàn)，運(yùn)用免疫熒光染色的方法檢測高爾基體和γ-tubulin再定位的情況，GSK-3β的磷酸化情況，從而探討p32對細(xì)胞極性的影響。肌動蛋白聚合實(shí)驗(yàn)，探討EGF刺激不同時間后肌動蛋白聚合的變化，采用磷

7、酸化特異性抗體檢測p32表達(dá)對EGF刺激后cofilin磷酸化水平的影響。
　　 10)建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染空載體，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染p32降表達(dá)的乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞系，將對照組和降表達(dá)組分別通過尾靜脈注射入SCID小鼠體內(nèi)，構(gòu)建實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)移小鼠模型，探討p32降表達(dá)在小鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)移的影響。
　　 結(jié)果:
　　 1) P32在乳腺癌組織中的表達(dá)較乳腺小葉增生組織中的表達(dá)明顯增高，而且這種高表達(dá)與腫瘤的TNM分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)

8、。
　　 2)P32在乳腺癌細(xì)胞中高表達(dá)，并在高轉(zhuǎn)移的細(xì)胞系MDA-MB-231、BT549、ZR-75-30細(xì)胞中的表達(dá)明顯要高于低轉(zhuǎn)移細(xì)胞系T47D。p32主要分布在線粒體中，也分布在細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核中，在EGF的刺激下，p32從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)位到細(xì)胞膜上。
　　 3)應(yīng)用小RNA干擾技術(shù)轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞后，p32的蛋白水平均明顯下降。
　　 4) P32降表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞的增殖能力比對照組明顯減弱（P＜0.0

9、5）。
　　 5) P32降表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞的趨化運(yùn)動能力和遷移能力比對照組明顯減弱(P＜0.001)。
　　 6)運(yùn)用線粒體有氧呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ抑制劑Rotenone，發(fā)現(xiàn)Rotenone對細(xì)胞的運(yùn)動沒有明顯影響。
　　 7)質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)，PKCζ、BAT2、CHCHD2、Lamin-B receptor等蛋白可以與p32相互作用。免疫共沉淀和免疫熒光的方法證實(shí)p32與PKCζ二者之間確實(shí)存在相互作用。而且在EG

10、F的刺激作用下，二者可以共定位于細(xì)胞膜。
　　 8)當(dāng)p32表達(dá)降低后，EGF誘導(dǎo)的PKCζ磷酸化和PKCζ的膜轉(zhuǎn)位都減少。但是PKCζ降表達(dá)對p32的膜轉(zhuǎn)位沒有影響。
　　 9)P32的74-144aa片段與PKCζ的調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域結(jié)合，用p32的不同片段轉(zhuǎn)染入降表達(dá)p32的細(xì)胞中，74-174aa片段可以拯救p32降表達(dá)細(xì)胞中EGF誘導(dǎo)的 PKCζ膜轉(zhuǎn)位，并部分恢復(fù)細(xì)胞的遷移能力。
　　 10)P32降表達(dá)后，劃

11、痕運(yùn)動中l(wèi)eading edge細(xì)胞的高爾基體和γ-tubulin的再定向減少，GSK-3β的磷酸化水平減弱，細(xì)胞的極性減弱。P32降表達(dá)的細(xì)胞F-actin聚合比對照組細(xì)胞減少(P＜0.05)。Western blot證實(shí)，降低p32的表達(dá)能夠明顯減低與F-actin聚合和解聚相關(guān)的cofilin的磷酸化水平。
　　 11) P32降表達(dá)細(xì)胞組在肺內(nèi)形成的轉(zhuǎn)移性癌結(jié)節(jié)明顯少于對照組。
　　 結(jié)論:
　　 1)

12、P32在人乳腺癌組織標(biāo)本中高表達(dá)，并與腫瘤病人的TNM分期和癌細(xì)胞的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)。
　　 2)P32在乳腺癌細(xì)胞中高表達(dá)，主要分布在線粒體，也分布在細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核。
　　 3)P32參與了EGF誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞的趨化運(yùn)動和遷移。P32降表達(dá)使乳腺癌細(xì)胞趨化運(yùn)動能力、遷移能力和細(xì)胞極性、肌動蛋白聚合能力都明顯減弱。
　　 4)P32在乳腺癌細(xì)胞的運(yùn)動中起重要作用，這種作用不依賴于細(xì)胞的有氧磷酸化。