壯骨健膝方對(duì)IL-1β誘導(dǎo)后大鼠軟骨細(xì)胞增殖及Ⅱ型膠原表達(dá)影響的研究.pdf

1、目的： 通過(guò)對(duì)比觀察壯骨健膝方及壯骨關(guān)節(jié)丸含藥血清對(duì)IL-1β誘導(dǎo)后關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞增殖、Ⅱ型膠原蛋白及其mRNA表達(dá)的影響，探討壯骨健膝方對(duì)損傷的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的保護(hù)效應(yīng)。 方法： 1．軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)體系的建立與鑒定：原代細(xì)胞應(yīng)用聯(lián)合酶消化法從4周齡SD大鼠關(guān)節(jié)軟骨獲取，并以倒置顯微鏡下的形態(tài)學(xué)表現(xiàn)及甲苯胺藍(lán)染色進(jìn)行鑒定。 2．MTT比色法觀察壯骨健膝方及壯骨關(guān)節(jié)丸含藥血清對(duì)正常和IL-1β誘導(dǎo)后軟骨細(xì)胞增

2、殖的影響； 3．免疫組化法觀察壯骨健膝方及壯骨關(guān)節(jié)丸含藥血清對(duì)正常和IL-1β誘導(dǎo)后軟骨細(xì)胞Ⅱ型膠原表達(dá)的影響； 4．RT-PCR法觀察壯骨健膝方及壯骨關(guān)節(jié)丸含藥血清對(duì)正常和IL-1β誘導(dǎo)后軟骨細(xì)胞Ⅱ型膠原mRNA表達(dá)的影響。 結(jié)果： 1．采用聯(lián)合酶消化方法建立大鼠軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)體系，經(jīng)倒置顯微鏡下形態(tài)學(xué)觀察及甲苯胺藍(lán)染色鑒定，確認(rèn)分離培養(yǎng)的細(xì)胞符合軟骨細(xì)胞的生物學(xué)特征。形態(tài)學(xué)、組織化學(xué)染色顯示軟骨細(xì)胞

3、培養(yǎng)傳3代以內(nèi)可以保持表型的穩(wěn)定。 2．對(duì)軟骨細(xì)胞增殖的觀察顯示：壯骨健膝方（ZGJXF）5%、10%、20%的含藥血清濃度均可促進(jìn)正常培養(yǎng)軟骨細(xì)胞的增殖，但增殖效應(yīng)不隨血清濃度的增加而呈比例遞增，其中10%血清濃度組在第48h時(shí)促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖作用最佳。在第48h時(shí)，對(duì)于正常培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞，10% ZGJXF含藥血清組與10%空白血清組比較有顯著差異（P<0．05），但與10%壯骨關(guān)節(jié)丸含藥血清組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0．0

4、5）；各組細(xì)胞的增殖效應(yīng)在第48h時(shí)均強(qiáng)于第72h時(shí)。關(guān)于不同濃度IL-1β誘導(dǎo)后軟骨細(xì)胞增殖的變化，以10ng/mlIL-1β誘導(dǎo)48h時(shí)對(duì)軟骨細(xì)胞增殖的抑制作用最強(qiáng)。關(guān)于含藥血清對(duì)IL-1β誘導(dǎo)后軟骨細(xì)胞增殖變化的影響，在第48h時(shí)，10% ZGJXF含藥血清能有效阻斷IL-1β對(duì)軟骨細(xì)胞增殖的抑制作用，10% ZGJXF含藥血清+10ng/mlIL-1β組與10%空白血清+10ng/mlIL-1β組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0．05）

5、，但與10%壯骨關(guān)節(jié)丸含藥血清+10ng/mlIL-1β組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0．05）。 3．免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示：各組標(biāo)本均可見(jiàn)Ⅱ型膠原陽(yáng)性表達(dá)，表達(dá)部位為胞漿，可見(jiàn)紅棕色顆粒或成片狀?？瞻?IL-1β組較空白組的Ⅱ型膠原表達(dá)顯著減弱（P<0．05）；ZGJXF+IL-1β組與空白+IL-1β組的Ⅱ型膠原表達(dá)的對(duì)比有明顯增強(qiáng)（P<0．05），但與壯骨關(guān)節(jié)丸+IL-1β組表達(dá)的比較無(wú)明顯差異（P>0．05）； ZGJXF組與

6、空白組的Ⅱ型膠原表達(dá)比較有顯著差異（P<0．05），但與壯骨關(guān)節(jié)丸組比較無(wú)明顯差異（P>0．05）。 4． RT-PCR結(jié)果：六組的mRNA擴(kuò)增產(chǎn)物中都能看到預(yù)期長(zhǎng)度的Ⅱ型膠原特異性條帶。空白+IL-1β組較空白組的Ⅱ型膠原mRNA表達(dá)顯著減弱（P<0．05）； ZGJXF+IL-1β組較空白+IL-1β組的Ⅱ型膠原mRNA表達(dá)明顯上調(diào)（P<0．05），但ZGJXF+IL-1β組與壯骨關(guān)節(jié)丸組+IL-1β組Ⅱ型膠原mRNA表達(dá)比