Notch1在肝癌組織中的表達及其對肝癌細胞侵襲能力的影響.pdf

1、原發(fā)性肝癌是世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一,在我國,原發(fā)性肝癌是排名第二的致死性腫瘤疾病,每年大約有11萬-13萬患者死于肝細胞性肝癌,占全球肝癌患者死亡人數(shù)的45％。隨著現(xiàn)代檢測及治療手段的進步,原發(fā)性肝癌治療取得了長足進展,但由于其較高的轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)率,總體預(yù)后依舊較差,積極尋找一種早期準確預(yù)測肝細胞肝癌惡性程度及預(yù)后的指標變得十分迫切。
　　Notch信號通路是一條進化上十分保守的信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng),可調(diào)控細胞增殖、分化、凋亡等生物

2、學行為。其主要由受體、配體、DNA結(jié)合蛋白三部分組成。在胞漿內(nèi)生成的Notch受體在高爾基體中經(jīng)Furin類轉(zhuǎn)化酶水解為兩部分,二者之間通過非共價鍵形成異源二聚體并被轉(zhuǎn)運到細胞膜表面,當受體與配體結(jié)合后,在γ-分泌酶的水解作用下,切割Notch受體跨膜區(qū),并釋放Notch胞內(nèi)段進入細胞核,從而啟動下游基因的轉(zhuǎn)錄,調(diào)控一系列生命活動。Notch1是Notch信號通路的跨膜受體之一,大量研究發(fā)現(xiàn),Notch1在多種腫瘤中異常表達,并且與腫瘤

3、侵襲及轉(zhuǎn)移相關(guān)。但在肝癌中,Notch1的作用尚不明確。
　　目的:
　　研究Notch1在肝細胞肝癌組織中的表達情況及其與肝癌臨床病理特征的關(guān)系。檢測不同侵襲能力肝腫瘤及非腫瘤細胞系中Notch1的表達情況,設(shè)計合成特異性Notch1-siRNA,研究Notch1在肝癌細胞系MHCC97-H及HepG2侵襲轉(zhuǎn)移中的作用及其相關(guān)潛在機制。
　　方法:
　　用免疫組織化學法(SP法)檢測110例肝癌組織及其癌旁組織

4、中Notch1表達情況,并分析Notch1表達與肝癌各項臨床病理指標之間的相關(guān)性。用Westernblot方法檢測肝非腫瘤細胞系HL-7702、肝癌細胞系HepG2和MHCC97-H三種不同侵襲能力的細胞系中Notch1蛋白的表達情況,設(shè)計并合成針對Notch1基因特異性的小干擾RNA(smallinterferingRNA,siRNA),采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染MHCC97-H及HepG2兩種肝癌細胞系,通過Western blot及實時定量P

5、CR法分別檢測轉(zhuǎn)染后各組細胞Notch1蛋白和mRNA表達水平的變化。應(yīng)用特異性Notch1-siRNA轉(zhuǎn)染的HepG2及MHCC97-H細胞,體外通過transwell小室基質(zhì)侵襲實驗,觀察Notch1表達沉默之后,這兩種肝癌細胞系侵襲能力的變化,并應(yīng)用Westernblot及ELISA的方法分別檢測兩種細胞系轉(zhuǎn)染前后MMP-2及MMP-9表達量以及活性的變化情況。
　　結(jié)果:
　　免疫組織化學染色發(fā)現(xiàn),Notch1陽性染

6、色主要位于細胞膜中,為棕色及棕黃色顆粒樣,細胞漿中也有所表達。在肝癌組織中,30例(27.3%)陰性表達,32例(29.1%)弱陽性表達,21例(19.1%)中等陽性表達,27例(24.5%)強陽性表達。Notch1在肝癌組織中表達存在差異。在癌旁組織中,僅部分染色顯示為弱陽性,其余均為陰性。肝癌組織中Notch1的陽性表達與肝癌的AJCC分期(χ2=22.123,P<0.001)、門靜脈癌栓(χ2=9.068,P=0.003)這些因素

7、存在正相關(guān)性,與肝癌的分化程度(χ2=6.490,P=0.011)存在負相關(guān)性;而與肝癌患者的性別(χ2=0.490,P=0.484)、年齡(χ2=0.188,P=0.664)、腫瘤直徑(χ2=0.002,P=0.961)、腫瘤數(shù)量(χ2=2.220,P=0.136)、AFP表達量(χ2=1.392,P=0.238)這些因素無關(guān)。
　　相比肝非腫瘤細胞系,Notch1在兩種肝癌細胞系中均高表達。特異性Notch1-siRNA轉(zhuǎn)染M

8、HCC97-H以及HepG2后,通過westernblot和實時定量PCR的方法檢測發(fā)現(xiàn)這兩種肝癌細胞系中Notch1蛋白以及mRNA的表達均顯著下降,該siRNA可以成功的干涉Notch1的表達。
　　應(yīng)用特異性Notch1-siRNA沉默肝癌細胞系MHCC97-H及HepG2中Notch1的表達,侵襲實驗結(jié)果顯示:Notch1-siRNA組兩種細胞系穿透小室膜的細胞數(shù)目明顯減少。Westernblot及ELLISA實驗檢測發(fā)現(xiàn)