Notch1在肝癌組織中的表達(dá)及其對(duì)肝癌細(xì)胞侵襲能力的影響.pdf

1、原發(fā)性肝癌是世界范圍內(nèi)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,在我國(guó),原發(fā)性肝癌是排名第二的致死性腫瘤疾病,每年大約有11萬(wàn)-13萬(wàn)患者死于肝細(xì)胞性肝癌,占全球肝癌患者死亡人數(shù)的45％。隨著現(xiàn)代檢測(cè)及治療手段的進(jìn)步,原發(fā)性肝癌治療取得了長(zhǎng)足進(jìn)展,但由于其較高的轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)率,總體預(yù)后依舊較差,積極尋找一種早期準(zhǔn)確預(yù)測(cè)肝細(xì)胞肝癌惡性程度及預(yù)后的指標(biāo)變得十分迫切。
　　Notch信號(hào)通路是一條進(jìn)化上十分保守的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng),可調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、凋亡等生物

2、學(xué)行為。其主要由受體、配體、DNA結(jié)合蛋白三部分組成。在胞漿內(nèi)生成的Notch受體在高爾基體中經(jīng)Furin類(lèi)轉(zhuǎn)化酶水解為兩部分,二者之間通過(guò)非共價(jià)鍵形成異源二聚體并被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞膜表面,當(dāng)受體與配體結(jié)合后,在γ-分泌酶的水解作用下,切割Notch受體跨膜區(qū),并釋放Notch胞內(nèi)段進(jìn)入細(xì)胞核,從而啟動(dòng)下游基因的轉(zhuǎn)錄,調(diào)控一系列生命活動(dòng)。Notch1是Notch信號(hào)通路的跨膜受體之一,大量研究發(fā)現(xiàn),Notch1在多種腫瘤中異常表達(dá),并且與腫瘤

3、侵襲及轉(zhuǎn)移相關(guān)。但在肝癌中,Notch1的作用尚不明確。
　　目的:
　　研究Notch1在肝細(xì)胞肝癌組織中的表達(dá)情況及其與肝癌臨床病理特征的關(guān)系。檢測(cè)不同侵襲能力肝腫瘤及非腫瘤細(xì)胞系中Notch1的表達(dá)情況,設(shè)計(jì)合成特異性Notch1-siRNA,研究Notch1在肝癌細(xì)胞系MHCC97-H及HepG2侵襲轉(zhuǎn)移中的作用及其相關(guān)潛在機(jī)制。
　　方法:
　　用免疫組織化學(xué)法(SP法)檢測(cè)110例肝癌組織及其癌旁組織

4、中Notch1表達(dá)情況,并分析Notch1表達(dá)與肝癌各項(xiàng)臨床病理指標(biāo)之間的相關(guān)性。用Westernblot方法檢測(cè)肝非腫瘤細(xì)胞系HL-7702、肝癌細(xì)胞系HepG2和MHCC97-H三種不同侵襲能力的細(xì)胞系中Notch1蛋白的表達(dá)情況,設(shè)計(jì)并合成針對(duì)Notch1基因特異性的小干擾RNA(smallinterferingRNA,siRNA),采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染MHCC97-H及HepG2兩種肝癌細(xì)胞系,通過(guò)Western blot及實(shí)時(shí)定量P

5、CR法分別檢測(cè)轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞Notch1蛋白和mRNA表達(dá)水平的變化。應(yīng)用特異性Notch1-siRNA轉(zhuǎn)染的HepG2及MHCC97-H細(xì)胞,體外通過(guò)transwell小室基質(zhì)侵襲實(shí)驗(yàn),觀察Notch1表達(dá)沉默之后,這兩種肝癌細(xì)胞系侵襲能力的變化,并應(yīng)用Westernblot及ELISA的方法分別檢測(cè)兩種細(xì)胞系轉(zhuǎn)染前后MMP-2及MMP-9表達(dá)量以及活性的變化情況。
　　結(jié)果:
　　免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn),Notch1陽(yáng)性染

6、色主要位于細(xì)胞膜中,為棕色及棕黃色顆粒樣,細(xì)胞漿中也有所表達(dá)。在肝癌組織中,30例(27.3%)陰性表達(dá),32例(29.1%)弱陽(yáng)性表達(dá),21例(19.1%)中等陽(yáng)性表達(dá),27例(24.5%)強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。Notch1在肝癌組織中表達(dá)存在差異。在癌旁組織中,僅部分染色顯示為弱陽(yáng)性,其余均為陰性。肝癌組織中Notch1的陽(yáng)性表達(dá)與肝癌的AJCC分期(χ2=22.123,P<0.001)、門(mén)靜脈癌栓(χ2=9.068,P=0.003)這些因素

7、存在正相關(guān)性,與肝癌的分化程度(χ2=6.490,P=0.011)存在負(fù)相關(guān)性;而與肝癌患者的性別(χ2=0.490,P=0.484)、年齡(χ2=0.188,P=0.664)、腫瘤直徑(χ2=0.002,P=0.961)、腫瘤數(shù)量(χ2=2.220,P=0.136)、AFP表達(dá)量(χ2=1.392,P=0.238)這些因素?zé)o關(guān)。
　　相比肝非腫瘤細(xì)胞系,Notch1在兩種肝癌細(xì)胞系中均高表達(dá)。特異性Notch1-siRNA轉(zhuǎn)染M

8、HCC97-H以及HepG2后,通過(guò)westernblot和實(shí)時(shí)定量PCR的方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)這兩種肝癌細(xì)胞系中Notch1蛋白以及mRNA的表達(dá)均顯著下降,該siRNA可以成功的干涉Notch1的表達(dá)。
　　應(yīng)用特異性Notch1-siRNA沉默肝癌細(xì)胞系MHCC97-H及HepG2中Notch1的表達(dá),侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:Notch1-siRNA組兩種細(xì)胞系穿透小室膜的細(xì)胞數(shù)目明顯減少。Westernblot及ELLISA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)