Caveolin-1在小鼠肝癌細(xì)胞Hepal-6中的穩(wěn)定表達(dá)及其對細(xì)胞生長的影響.pdf

1、背景與目:的胞膜窖(caveolae)是50～100nm燒瓶狀的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，和信號傳導(dǎo)密切相關(guān)。窖蛋白-1(caveolin-1)是胞膜窖的主要結(jié)構(gòu)成分，在細(xì)胞內(nèi)吞、膽固醇運(yùn)輸、信號傳導(dǎo)、腫瘤轉(zhuǎn)化中發(fā)揮著重要的作用。 研究表明，幾乎所有正常細(xì)胞均有caveolin-1的表達(dá)，而在大多數(shù)腫瘤細(xì)胞如乳腺癌細(xì)胞和肺癌細(xì)胞中，caveolin-1表達(dá)下降或無表達(dá)，重新表達(dá)caveolin-1會抑制腫瘤細(xì)胞生長及腫瘤細(xì)胞集落的形成，反義核

2、酸抑制caveolin-1表達(dá)則會增強(qiáng)細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力，提示caveolin-1可能具有抑瘤作用，因此caveolin-1基因被許多學(xué)者認(rèn)為是候選的抑癌基因。然而近年研究表明，在前列腺癌細(xì)胞和膀胱癌細(xì)胞中caveolin-1高表達(dá)，而且表達(dá)水平與前列腺癌細(xì)胞和膀胱癌細(xì)胞細(xì)胞淋巴道轉(zhuǎn)移潛能呈正相關(guān)；通過RNAi下調(diào)caveolin-1的表達(dá)能夠抑制腫瘤細(xì)胞的生長、轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)移能力，因此caveolin-1還被認(rèn)為是淋巴道轉(zhuǎn)移相關(guān)基因。所以，深入

3、研究caveolin-1在不同腫瘤細(xì)胞中的作用有重要的意義。 目前，有關(guān)caveolin-1和肝癌轉(zhuǎn)移方面的報(bào)道很少。本課題組前期工作表明，在HCa-F(高淋巴道轉(zhuǎn)移株)中caveolin-1表達(dá)量高于HCa-P(低淋巴道轉(zhuǎn)移株)和Hepa1-6(無淋巴道轉(zhuǎn)移)，在Hepa1-6細(xì)胞中沒有檢測到caveolin-1的表達(dá)，提示caveolin-1在小鼠肝癌細(xì)胞淋巴道轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用。 本文旨在通過克隆小鼠caveolin-

4、1cDNA、構(gòu)建其表達(dá)載體并將其穩(wěn)定表達(dá)于小鼠肝癌細(xì)胞Hepa1-6中，觀察Hepa1-6細(xì)胞生物學(xué)的變化，為進(jìn)一步研究caveolin-1在小鼠肝癌細(xì)胞淋巴道轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 方法: 1.從小鼠肺組織中提取總RNA，利用caveolin-1特異性引物經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增caveolin-1cDNA24-557bp片段，克隆至PMD18-Tsimplevector，然后亞克隆到真核表達(dá)載體質(zhì)粒pEGFP-N2上

5、，經(jīng)轉(zhuǎn)化、抗生素初步篩選、限制性核酸內(nèi)切酶酶切和DNA測序獲得重組質(zhì)粒pEGFP-N2/Cav1。 2.利用脂質(zhì)體將重組質(zhì)粒pEGFP-N2/Cav1轉(zhuǎn)染至小鼠肝癌細(xì)胞Hepa1-6上，空載體做對照，經(jīng)G418篩選及RT-PCR和Westernblot分析，獲得穩(wěn)定表達(dá)株。 3.MTT法檢測caveolin-1對Hepa1-6細(xì)胞生長和增殖的影響，并利用軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞生物學(xué)性狀的變化。 結(jié)果:

6、 1.利用RT-PCR從小鼠肺組織總RNA中成功克隆出546bp的caveolin-1cDNA的24-557bp片斷，重組陽性克隆經(jīng)酶切和測序鑒定證實(shí)目的基因已正確插入pEGFP-N2表達(dá)載體中，且與載體上的GFP基因處于同一開放閱讀框，記為pEGFP-N2/Cav1。 2.利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)，G418篩選獲得4個穩(wěn)定表達(dá)外源caveolin-1的Hepa1-6細(xì)胞株，記為Hepa1-6/Cav1。并經(jīng)RT-PCR、Wester

7、nblot方法證實(shí)外源caveolin-1基因整合到Hepa1-6細(xì)胞基因組中。免疫細(xì)胞化學(xué)和電鏡結(jié)果表明，caveolin-1在Hepa1-6細(xì)胞胞膜和胞漿中均有表達(dá)。 3.與轉(zhuǎn)染空載體組細(xì)胞(Hepa1-6/mock)和未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞Hepa1-6比較，Hepa1-6/Cav1組細(xì)胞增殖無明顯改變(P＞0.01)；但在軟瓊脂中的集落形成數(shù)明顯增加(P＜0.01)。 結(jié)論: 1.構(gòu)建了小鼠caveolin-1cD