TRIM22的E3泛素連接酶活性及其所介導(dǎo)生物學(xué)意義的研究.pdf

1、三結(jié)構(gòu)域蛋白家族(tripartite motif,TRIM)屬于含有RING(really interestingnew gene)結(jié)構(gòu)域的RBCC蛋白家族的一大類分子,目前發(fā)現(xiàn)TRIM家族有近70個成員,含有相似的RBCC結(jié)構(gòu)序列,包括一個RING區(qū)、一個或兩個B-box區(qū)和一個卷曲螺旋區(qū)(coiled-coil)。C末端的結(jié)構(gòu)域則高度可變。研究顯示,TRIM蛋白家族成員參與多種細胞生物學(xué)過程,如細胞增殖、分化、發(fā)育、抗病毒、癌變和

2、凋亡等等。RING結(jié)構(gòu)域也是一大類RING E3泛素連接酶所共有的特征性結(jié)構(gòu)域。TRIM家族成員也具有特征性的RING結(jié)構(gòu)域,因而有理由認為TRIM家族成員可能同樣具有E3泛素連接酶活性。迄今為止報道具有E3泛素連接酶活性的TRIM家族成員有:TRIM5α、TRIM19、TRIM21、TRIM25和TRIM37等。如TRIM25通過對模式識別受體RIG-Ⅰ的特異性降解作用,影響RIG-Ⅰ對RNA病毒的識別和下游信號通路的活化,從而影響機

3、體的抗病毒固有免疫應(yīng)答。TRIM21通過對IRF-8的泛素化降解作用,調(diào)節(jié)免疫細胞如T細胞和巨噬細胞的活化和細胞因子分泌,從而影響機體免疫應(yīng)答。TRIM家族成員參與多種細胞生物學(xué)過程,可能通過其泛素連接酶活性發(fā)揮效應(yīng),值得重視研究。
　　 本研究中TRIM22(Tripartite motif-containing 22)為TRIM家族的成員之一,又稱為50kDa的刺激反式作用因子(stimulated trans-acting

4、 factor of 50 kDa,Staf50)。TRIM22是干擾素誘導(dǎo)表達的基因之一,同時TRIM22也是p53的靶基因之一,然而TRIM22的具體功能還不是很清楚。已有研究證明TRIM22具有抗細胞增殖、抗病毒的能力,可能是一種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。目前還未見其具有泛素連接酶活性的報道,其生物學(xué)功能與泛素連接酶活性的關(guān)系也是未知的,因而本研究主旨是通過體外體內(nèi)實驗證實TRIM22的E3泛素連接酶活性并探索其泛素連接酶活性所介導(dǎo)的生物學(xué)意

5、義。
　　 第一部分 TRIM22的E3泛素連接酶活性判斷一個蛋白為E3泛素連接酶,若此時對其靶蛋白還未知,為了證實其泛素連接酶活性可以首先證實其具有將自身進行泛素化的能力,即自身泛素化,這也是幾乎所有E3泛素連接酶所共同具有的特點,因而我們在本部分研究了TRIM22的自身泛素化能力。采用RT-PCR的方法擴增全長TRIM22開放閱讀框架(ORF),將其克隆入真核表達載體pcDNA3.1/myc-His(-)。為了進行體外泛素連

6、接酶活性檢測,我們構(gòu)建帶有GST標(biāo)簽的重組真核TRIM22表達載體pEBG/TRIM22,在真核細胞COS7表達GST-TRIM22,用GST樹脂凝膠純化TRIM22,體外泛素化反應(yīng)直接在結(jié)合GST-TRIM22的的凝膠上進行。兔網(wǎng)織紅細胞裂解液具有所有種類的E1泛素活化酶和多種E2泛素結(jié)合酶,加入TRIM22和Ub進行反應(yīng)后,用抗Ub抗體進行檢測發(fā)現(xiàn)大分子量的拖帶,表明TRIM22被加上多聚泛素鏈,進一步我們選擇一個E2混合物(Ubc

7、H2、UbcH5B、UbcH7、UbcH10和hCDC34)進行體外泛素化反應(yīng),結(jié)果發(fā)現(xiàn)TRIM22也被泛素化,這些結(jié)果證明TRIM22是一個E3泛素連接酶,參與自身泛素化的過程。為確定TRIM22特異的E2,我們選擇分別用幾種具有代表性的E2(UbcH2、UbcH5B、UbcH7、UbcH10和hCDC34)進行體外泛素化反應(yīng),發(fā)現(xiàn)UbcH5B是TRIM22進行自身泛素化反應(yīng)所需要的E2。為在體內(nèi)驗證TRIM22的泛素連接酶活性,我們

8、構(gòu)建了C端帶有myc表位的TRIM22重組真核表達質(zhì)粒pcDNA/TRIM22-myc,將其與HA-Ub質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細胞,用抗c-myc抗體進行免疫沉淀,用抗HA抗體檢測發(fā)現(xiàn)TRIM22與HA—Ub共轉(zhuǎn)染組有明顯的大分子量拖帶,為典型的多聚泛素化反應(yīng)。同時我們觀察了蛋白酶體抑制劑MG132對TRIM22泛素化反應(yīng)的影響,發(fā)現(xiàn)MG132能夠促進帶有泛素鏈的TRIM22聚集而不能被蛋白酶體降解。為研究TRIM22泛素連接酶活性是否依賴

9、RING結(jié)構(gòu)域,我們分別將TRIM22的RING結(jié)構(gòu)域第15位關(guān)鍵氨基酸進行突變(C15A)和整個RING結(jié)構(gòu)域缺失(Del-R),體外體內(nèi)實驗結(jié)果顯示其自身泛素化程度明顯下降或消失,表明TRIM22的泛素連接酶活性依賴于RING結(jié)構(gòu)域,是一個新的依賴RING結(jié)構(gòu)域E3泛素連接酶。
　　 第二部分 TRIM22的E3泛素連接酶活性介導(dǎo)的生物學(xué)意義第一部分證明了TRIM22具有體內(nèi)體外的E3泛素連接酶活性,然而TRIM22作用的蛋

10、白底物還不清楚,即其具有泛素連接酶活性的意義還未知并值得去探索。已有的研究結(jié)果顯示TRIM22具有抗細胞增殖、抗病毒和促進細胞凋亡等功能,然而沒有研究提示TRIM22的這些功能與泛素蛋白酶體系統(tǒng)相關(guān)。
　　 有芯片研究結(jié)果報道,相比于正常個體,來源于自身免疫性疾病系統(tǒng)性紅斑狼瘡病人病情活動期的CD4+T細胞表達高水平的TRIM22,提示TRIM22可能與自身免疫性疾病相關(guān)。已有研究認為TRIM家族成員可能是潛在的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子,而

11、自身免疫性疾病常伴隨著關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子NF-κB轉(zhuǎn)錄活性的功能失調(diào)。綜合考慮相關(guān)研究背景,我們大膽猜想TRIM22、自身免疫性疾病和NF-κB信號通路這三者之間存在某種聯(lián)系,TRIM22通過影響NF-κB轉(zhuǎn)錄活性,繼而與自身免疫性疾病的致病機制相關(guān)聯(lián)。NF-κB轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)節(jié)與泛素蛋白酶體系統(tǒng)有著密切的聯(lián)系,其活性受到多種E3泛素連接酶的調(diào)節(jié)。第一部分已經(jīng)證實TRIM22具有E3泛素連接酶活性,我們考慮TRIM22的泛素連接酶活性是否也參與

12、對NF-κB信號通路的調(diào)節(jié),這也可為TRIM22泛素化作用的蛋白底物和介導(dǎo)的生物學(xué)意義找到線索?；诖宋覀儑L試探索TRIM22對NF-κB轉(zhuǎn)錄活性的影響。通過螢光素酶報告基因的方法我們檢測了TRIM22對NF-κB、NF-AT和AP-1的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),TRIM22能夠促進NF-κB啟動子的活性,然而TRIM22對AP-1和NF-AT通路的影響不大。蛋白酶體抑制劑MG132能夠抑制NF-κB的活化,同樣發(fā)現(xiàn)TRIM22對NF-κB的活化

13、作用也被MG132抑制,提示TRIM22對NF-κB的活化作用是通過泛素蛋白酶體途徑實現(xiàn)。TRIM22促進NF-κB轉(zhuǎn)錄活性的作用也依賴于其與泛素連接酶活性密切相關(guān)的RING結(jié)構(gòu)域。進一步研究發(fā)現(xiàn)缺失SPRY結(jié)構(gòu)域的TRIM22也喪失了促進NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性的能力。為了解釋這個現(xiàn)象,我們考慮是SPRY結(jié)構(gòu)域缺失使其蛋白定位發(fā)生改變所致。通過帶有C端Myc標(biāo)記的TRIM22的不同結(jié)構(gòu)域缺失和突變體,用間接免疫熒光方法觀察轉(zhuǎn)染這些異構(gòu)體后

14、其在COS7細胞內(nèi)的定位。發(fā)現(xiàn)TRIM22主要定位于胞核內(nèi),而RING結(jié)構(gòu)域?qū)ζ涠ㄎ粵]有影響。缺失SPRY結(jié)構(gòu)域后TRIM22定位發(fā)生改變,不能進入胞核。我們推測TRIM22促進NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性不僅與其泛素連接酶活性相關(guān),與其定位也相關(guān),TRIM22可能在細胞核內(nèi)參與對NF-κB信號通路某個抑制分子的泛素降解。
　　 綜上所述,本研究通過體內(nèi)體外泛素化檢測證實了TRIM22具有核泛素連接酶活性,而且其泛素連接酶活性依賴于其R