結(jié)核分枝桿菌分泌蛋白ESAT-6、Ag85B對(duì)外周血FoxP3mRNA的誘導(dǎo)作用.pdf

1、背景和目的:結(jié)核病是我國重大傳染病之一,是嚴(yán)重危害我國人群健康的呼吸道傳染病。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),耐藥性空洞型肺結(jié)核病人經(jīng)有效手術(shù)治療后,CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)細(xì)胞水平明顯下降。CD4+CD25+Treg細(xì)胞水平上調(diào)與結(jié)核分枝桿菌感染存在高度相關(guān)性,但其產(chǎn)生機(jī)制并不清楚。因此我們選取結(jié)核菌分泌蛋白ESAT-6和Ag85B對(duì)人外周血進(jìn)行刺激,運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血中CD4+CD25+Treg細(xì)胞(％PBMC),證明

2、經(jīng)蛋白刺激后CD4+CD25+Treg細(xì)胞明顯升高。由于CD25在活化的T細(xì)胞(包括CD4+CD25-T細(xì)胞)中表達(dá),而叉頭樣轉(zhuǎn)錄因子FoxP3在激活的CD4+CD25-T細(xì)胞上并不表達(dá),是CD4+CD25+Treg細(xì)胞的特異性生物標(biāo)志,其表達(dá)水平與CD4+CD25+Treg細(xì)胞數(shù)量成正相關(guān)。因CD25作為明確的Treg的生物標(biāo)志受限,為了更精確的檢測(cè)Treg水平,應(yīng)用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)FoxP3 mRNA表達(dá)水平。本論文主要通過檢測(cè)

3、FoxP3 mRNA表達(dá)水平,從基因水平上觀察經(jīng)ESAT-6和Ag85B刺激后的外周血CD4+CD25+FoxP3+Treg細(xì)胞改變,為研究結(jié)核分枝桿菌誘導(dǎo)CD4+CD25+FoxP3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞上調(diào)產(chǎn)生免疫逃逸機(jī)制提供新的依據(jù)。
　　材料和方法:
　　1.對(duì)汕頭市第三人民院進(jìn)行結(jié)核病流行病學(xué)調(diào)查,獲取痰培養(yǎng)和藥敏試驗(yàn)及病人的一般信息,描述當(dāng)?shù)亟Y(jié)核病分布情況。
　　2.從健康人群、潛伏期感染者、耐藥性結(jié)核病病人中隨機(jī)

4、選取志愿者,對(duì)其空腹靜脈取血。
　　3.采用不同濃度(0μg/ml、1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml)的ESAT-6、Ag85B、ESAT-6+Ag85B、BCG處理血液,培養(yǎng)24h、48h、72h后,實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)FoxP3 mRNA表達(dá)水平。
　　結(jié)果:
　　1.結(jié)核病流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn),痰培養(yǎng)陽性者中男性多于女性,且男性年齡高于女性。而藥敏試驗(yàn)中耐藥性結(jié)核病所占比例偏高。
　　2.不同濃度ES

5、AT-6,Ag85B刺激外周血24h、48h、72h后發(fā)現(xiàn)隨濃度的增加,FoxP3 mRNA有升高趨勢(shì),培養(yǎng)24小時(shí)FoxP3 mRNA表達(dá)水平最高,后隨時(shí)間延長有下降趨勢(shì),但均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　3.在未經(jīng)分泌蛋白刺激前,三組(健康對(duì)照組、潛伏期感染組、病例組)中FoxP3 mRNA表達(dá)水平比較,病例組與潛伏期感染組高于對(duì)照組,但病例組和潛伏期感染組間比較差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　4.分泌蛋白處理前后比較,經(jīng)ESAT-6、A

6、g85B、ESAT-6+Ag85B處理后FoxP3 mRNA水平高于處理前水平(P<0.05),但BCG處理后FoxP3 mRNA略有升高,但差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　5.不同蛋白處理后三組間比較發(fā)現(xiàn),潛伏期感染組經(jīng)抗原刺激后,FoxP3 mRNA水平高于病例組和健康對(duì)照組。病例組低于對(duì)照組,但無統(tǒng)計(jì)意義。
　　結(jié)論:目前耐藥性結(jié)核病流行,迫切需要了解結(jié)核菌的免疫逃逸機(jī)制以尋找治療辦法。經(jīng)體外抗原刺激外周血培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),外周血