共表達(dá)Ag85B、ESAT-6及小鼠IFN-γ重組卡介苗和Ag85B、ESAT-6嵌合蛋白亞單位疫苗的初步研究.pdf

1、結(jié)核病正對(duì)人類(lèi)構(gòu)成巨大的威脅.目前全球接近32％的人口已感染了結(jié)核桿菌.每年約有300萬(wàn)人死于結(jié)核病,平均每天死亡超過(guò)8000人.更為嚴(yán)重的是近十幾年來(lái)由于結(jié)核耐藥株增多和HIV/AIDS的蔓延,結(jié)核病發(fā)病率增高,已經(jīng)成為傳染病中的第二大殺手.目前全球廣泛使用的唯一的結(jié)核病疫苗是卡介苗(BCG).至今已有30億以上的人接種了BCG,并且每年有1億左右的新生兒接種此疫苗.它可以較好的阻止年幼兒粟粒型結(jié)核及結(jié)核性腦膜炎的發(fā)生.但是,它不能保

2、護(hù)最常見(jiàn)的成人肺結(jié)核的發(fā)生.所以研制新型的結(jié)核疫苗刻不容緩,這對(duì)于控制結(jié)核傳染具有非常重大的意義。當(dāng)前疫苗研究的主要有兩個(gè)方向:(1)研制重組卡介苗,使其比親代卡介苗具有更強(qiáng)的抗原性和免疫性,以代替現(xiàn)在使用的卡介苗:(2)研制亞單位疫苗,用于BCG免疫后的加強(qiáng)免疫.因此本研究工作包括兩個(gè)方面:重組BCG疫苗的研究和嵌合蛋白亞單位疫苗的研究. 1.重組BCG疫苗的研究 BCG是很好的活的疫苗載體,可以誘導(dǎo)較強(qiáng)的細(xì)胞免疫和體

3、液免疫反應(yīng).將一些重要的結(jié)核桿菌抗原基因?qū)隑CG,讓BCG大量表達(dá)保護(hù)性抗原,有望誘導(dǎo)比BCG強(qiáng)大而又持久的免疫保護(hù)力.本研究選擇結(jié)核分枝桿菌最重要的保護(hù)性抗原Ag85B,BCG在傳代過(guò)程中丟失的保護(hù)性抗原ESAT-6及重要的細(xì)胞因子IFN-Y,重組入BCG,構(gòu)建了三株重組BCG菌株,分別是rBCG-Ag85B(簡(jiǎn)稱(chēng)rBCG-A)、rBCG-Ag85B-ESAT6(簡(jiǎn)稱(chēng)rBCG-AE)、rBCG-Ag85B-ESAT6-IFN Y(簡(jiǎn)

4、稱(chēng)rBCG-AEI),其中rBCG-AEI的構(gòu)建是國(guó)內(nèi)外首次報(bào)道. 我們?cè)贐CG和三株重組BCG菌株免疫C57BL/6小鼠后,通過(guò)分析抗體IgG水平、IgG2b/IgGl和IFN-Y的分泌,比較了它們的免疫原性.研究結(jié)果表明,三株重組BCG針對(duì)特異抗原均可以引起特異性的較BCG強(qiáng)的體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng).其中rBCG-AEI的免疫原性較高,而且還能誘導(dǎo)較其它重組BCG高的Thl反應(yīng),而后者是成為成功疫苗的重要因素. 而且

5、我們進(jìn)一步觀(guān)察了重組BCG的免疫保護(hù)效果.皮下免疫C57BL/6小鼠和豚鼠(劑量分別為5×106 和5×104 cfu),8周后給予結(jié)核桿菌毒力標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv攻擊,觀(guān)察攻擊后菌落計(jì)數(shù)、體重變化和組織病理變化.研究結(jié)果顯示攻擊后9周rBCG-AEI免疫的小鼠肺部菌落數(shù)較少,凈體重增加.雖然肺部組織的病理改變與BCG和其它重組BCG無(wú)明顯差別,但抗酸染色顯示rBCG-AEI免疫的小鼠肺部組織的結(jié)核桿菌數(shù)最少.因此rBCG-AEI能夠產(chǎn)生與

6、BCG,rBCG-A和rBCG-AE相當(dāng)甚至更好的保護(hù)作用.當(dāng)然為了進(jìn)一步區(qū)分重組BCG與BCG疫苗的保護(hù)效率差異,還需要延長(zhǎng)毒力株攻擊后觀(guān)察時(shí)間. 2.嵌合蛋白亞單位疫苗的研究 Ag85B,ESAT-6是結(jié)核桿菌重要的保護(hù)性抗原.其抗原表位已得到廣泛研究,其中ESAT-6的T細(xì)胞抗原表位位于蛋白分子的N端及第5l～60氨基酸之間;.Ag85B的T細(xì)胞抗原表位位于蛋白分子C端的第241～260氨基酸之間和第26l～280

7、氨基酸之間.我們依據(jù).Ag85B,ESAT-6的T細(xì)胞抗原表位,將ESAT-6插入到Ag85B第169～182氨基酸之間形成嵌合蛋白:Ag85BN-ESAT-6-Ag85Bc.研究發(fā)現(xiàn)這種新的嵌合蛋白疫苗與佐劑MPL-TDM共免疫小鼠后,IgG2b/IgGl的比例和IFN吖的分泌都比Ag85B-ESAT-6融合蛋白高,后者已被報(bào)道在結(jié)核桿菌感染后可以產(chǎn)生與BCG相似的保護(hù)效果.因此,Ag85B,ESAT-6嵌合亞單位疫苗有可能成為一種有