表達(dá)牛分枝桿菌ESAT-6蛋白的重組產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌的構(gòu)建及其免疫特性研究.pdf

1、牛結(jié)核病是一種主要由牛分枝桿菌引起的重要人獸共患病，是全球重要公共衛(wèi)生問題之一。由于卡介苗(BCG)作為現(xiàn)今唯一獲準(zhǔn)使用的結(jié)核疫苗存在保護(hù)作用變動性大等諸多問題，研制新型抗結(jié)核疫苗已成為全世界急待解決的重要問題。機(jī)體細(xì)胞免疫應(yīng)答在抗牛分枝桿菌感染中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，因此提高細(xì)胞免疫應(yīng)答水平是研究新型結(jié)核疫苗的關(guān)鍵所在。本研究選用能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈CD8+T細(xì)胞免疫應(yīng)答的產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特細(xì)菌犯isteria monocytogenes

2、，以下簡寫為Lm)作為載體，運(yùn)送存在于致病性分枝桿菌中的富含T細(xì)胞表位的重要保護(hù)性抗原ESAT-6，并研究表達(dá)抗原ESAT-6的重組產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌的免疫特性，評價(jià)重組菌作為候選疫苗株的潛力，為新型結(jié)核疫苗的研制奠定基礎(chǔ)。 1、表達(dá)牛分枝桿菌ESAT-6蛋白的重組產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌的構(gòu)建采用PCR方法從產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌Lm4株基因組中擴(kuò)增出hly基因的上下游同源片段hlya和hlyb，從質(zhì)粒pET-3a(+)-esat-6中

3、擴(kuò)增出目的基因esat-6。再采用Splicing overlap extention PCR方法將擴(kuò)增的3個(gè)片段拼接成hlya-esat-6-hlyb復(fù)合片段。利用雙酶切反應(yīng)將hlya-esat-6-hlyb復(fù)合片段插入pGEM-T載體。經(jīng)測序鑒定正確后，再將hlya-esat-6-hlyb復(fù)合片段從pGEM-T載體上切下插入穿梭載體pKSV7，構(gòu)建成重組穿梭質(zhì)粒pKSV7一hlya-esat-6-hlyb，鑒定正確后分別電轉(zhuǎn)化感受態(tài)

4、Lm4和Lm△actA/plc。經(jīng)過抗生素和高溫雙重選擇壓力實(shí)現(xiàn)同源重組，得到2株重組細(xì)菌Lm(esat-6和Lm△actA/plcB(esat-6)。應(yīng)用2對引物對重組菌進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果表明外源基因esat-6定點(diǎn)整合于載體菌基因組中。體外穩(wěn)定性檢驗(yàn)表明，esat-6基因能在載體細(xì)菌基因組中長期穩(wěn)定存在。這為進(jìn)一步研究重組菌的免疫特性提供了材料。 2、表達(dá)牛分枝桿菌ESAT-6蛋白的重組產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌的免疫特性研究在

5、成功獲得2株插入有esat-6基因的重組產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌Lm(esat-6)、Lm△actA/plcB(esat-6)的基礎(chǔ)上，對重組菌的免疫特性進(jìn)行了研究。RT-PCR試驗(yàn)結(jié)果表明目的基因esat-6能有效轉(zhuǎn)錄。重組菌培養(yǎng)上清溶血試驗(yàn)顯示融合蛋自LLO-ESAT-6仍然具有溶血活性，溶血效價(jià)達(dá)24。LLO作為標(biāo)簽蛋白從蛋白質(zhì)水平上證實(shí)目的抗原ESAT-6的表達(dá)。細(xì)胞侵襲試驗(yàn)和小鼠半數(shù)致死量測定表明重組菌對細(xì)胞的侵襲能力明顯下降、對小

6、鼠的毒性顯著降低，且Lm△actA/plcB(esat-6)的毒力更低。用Lm(esat-6)和Lm△actA/plcB(esat-6)免疫C57BL/6小鼠后，在1×106個(gè)脾臟淋巴細(xì)胞中分泌特異性INF-γ的細(xì)胞個(gè)數(shù)最高分別達(dá)177和178個(gè)，而誘導(dǎo)產(chǎn)生IL-4的能力不明顯，這表明主要引起小鼠Th1型細(xì)胞免疫應(yīng)答；能刺激小鼠淋巴細(xì)胞發(fā)生特異性增殖，并能引發(fā)一定的遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng)。以上結(jié)果表明重組菌具有良好的生物安全性，能引起一定的特異