豬SLA-DRA、SLA-DRB基因的克隆及其在大腸桿菌中的融合表達(dá).pdf

1、首先根據(jù)GenBank登錄的SLA-DRA和SLA-DRB基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，引物兩端分別加上BamHⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)及保護(hù)堿基。通過反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PT-PCR)技術(shù)，從長白豬腸系淋巴結(jié)組織總RNA中擴(kuò)增出兩條特異性基因片段。PCR產(chǎn)物分離純化后連接到pMD18-T載體，經(jīng)菌液PCR和雙酶切反應(yīng)篩選出陽性重組克隆后進(jìn)行序列測定。結(jié)果表明本試驗(yàn)成功克隆了SLA-DRA和SLA-DRB基因，兩者分別由759和801個(gè)核苷酸組

2、成，分別編碼252和266個(gè)氨基酸。對SLA-DRA和SLA-DRB的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行生物信息學(xué)預(yù)測，發(fā)現(xiàn)SLA-DRA氨基酸序列中有2個(gè)潛在的N-糖基化位點(diǎn)，Asn141、Asn244可被糖基化，SLA-DRB氨基酸序列中有1個(gè)潛在的N-糖基化位點(diǎn)，Asn48可被糖基化。SLA-DRA有4個(gè)主要的疏水區(qū)，SLA-DRB表現(xiàn)出較強(qiáng)的親水性。SLA-DRA氨基酸序列中有12個(gè)潛在的磷酸化位點(diǎn)：Ser38、Ser42，Ser116，Ser15

3、6，Ser179，Thr64，Thr97，Thr207，Thr216、Thr246，Tyr36和Tyr184，SLA-DRB氨基酸序列中有13個(gè)潛在的磷酸化位點(diǎn)：Ser71、Ser92、Ser196、Ser208、Ser221、Ser223、Thr32、Thr50、Thr80、Thr129、Thr186、Thr210和Tyr107。 本研究將SLA-DRA、SLA-DRB基因定向克隆到原核表達(dá)載體pET32a(+)中，構(gòu)建了重組

4、融合表達(dá)質(zhì)粒子pET32a-DRA、pET32a-DRB，轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)，用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，優(yōu)化表達(dá)條件，并初步純化重組融合蛋白，結(jié)果表明：SLS-DRA、SLA-DRB基因在重組融合表達(dá)質(zhì)粒pET32a(+)中的插入方向和讀碼框均正確；SLA-DRA、SLA-DRB基因己在E.coliBL21(DE3)中實(shí)現(xiàn)了融合表達(dá)，其表達(dá)量分別占菌體總蛋白的19.88％、17.26％，對表達(dá)條件進(jìn)行了優(yōu)化，其表達(dá)量分別達(dá)26