硒對于氧化損傷大鼠肝細(xì)胞糖代謝關(guān)鍵酶的影響及其機(jī)制的研究.pdf

1、目的： 研究硒對于氧化損傷肝細(xì)胞糖代謝關(guān)鍵酶表達(dá)的影響，為進(jìn)一步研究硒改善糖尿病糖代謝紊亂的分子機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法： 1.氧化損傷細(xì)胞模型的建立及鑒定：采用不同濃度的H2O2(0.05、0.1、0.2、0.5、1mmol/L)誘導(dǎo)正常大鼠肝細(xì)胞(BRL)建立了氧化損傷的細(xì)胞模型，并通過細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察、MTT實(shí)驗(yàn)和抗氧化指標(biāo)檢測進(jìn)行模型鑒定。 2.硒對細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用研究：細(xì)胞分為5組，正常對照

2、組、損傷模型組(H2O2濃度為0.1mmol/L)、損傷+低劑量補(bǔ)硒組(Se-L組)、損傷+中劑量補(bǔ)硒組(Se-M組)、損傷+高劑量補(bǔ)硒組(Se-H組)，其中Na2SeO3終濃度分別為0.05、0.1和1μmol/L。通過測定細(xì)胞活力測定、抗氧化指標(biāo)和細(xì)胞凋亡率研究硒對氧化損傷細(xì)胞的保護(hù)作用，并通過實(shí)時定量PCR技術(shù)檢測細(xì)胞GSH-Px的mRNA的表達(dá)水平探討其作用機(jī)制。 3.硒對于氧化損傷肝細(xì)胞糖代謝酶的影響：細(xì)胞分組同前，采

3、用實(shí)時定量PCR技術(shù)測定細(xì)胞糖代謝、胰島素信號通路和細(xì)胞凋亡通路中關(guān)鍵蛋白葡萄糖激酶(glucokinase，GK)、糖原合成酶(glycogen synthase，GS)、蛋白激酶B(proteinkinase B，PKB/Akt)和凋亡信號調(diào)節(jié)激酶1(apoptosis signal regulating kinase 1，ASK1)的mRNA表達(dá)情況；采用酶聯(lián)免疫法(ELISA)檢測細(xì)胞中GK、糖原合成酶激酶3(glycogen

4、synthase kinase-3，GSK-3)蛋白表達(dá)水平；并通過Western blot檢測胰島素和細(xì)胞凋亡信號通路蛋白Akt和ASK1的表達(dá)情況。 結(jié)果： 1.體外BRL氧化損傷模型的建立：形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果顯示，與正常對照組相比，0.05～0.2mmol/LH2O2損傷組細(xì)胞變形，但細(xì)胞邊界尚清楚，0.5和1mmol/LH2O2損傷組細(xì)胞明顯變形，胞膜邊緣不清晰，有較多細(xì)胞脫落。H2O2氧化損傷組細(xì)胞活力MTT(OD

5、)降低，與正常對照組相比，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，并且隨著H2O2濃度升高，MTT有降低趨勢。氧化損傷組細(xì)胞谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)和超氧化物歧化酶I(superoxide dismutase，SOD)活性降低，丙二醛(maleicdialdehyde，MDA)含量升高，與正常對照組相比，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。 2.補(bǔ)硒對體外氧化損傷肝細(xì)胞的保護(hù)作用：

6、倒置相差顯微鏡觀察，損傷組細(xì)胞變形，細(xì)胞間隙增大，Se-L組與損傷組相比，細(xì)胞形態(tài)稍有改善，細(xì)胞間隙縮小，細(xì)胞間連接增加；Se-M和Se-H組與損傷組相比，細(xì)胞間隙明顯縮小，形態(tài)基本恢復(fù)正常。補(bǔ)硒組細(xì)胞MTT(OD)值、GSH-Px和SOD活性高于H2O2損傷模型組，MDA含量和細(xì)胞凋亡率低于損傷模型組，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。補(bǔ)硒組細(xì)胞GSH-Px的mRNA表達(dá)水平高于損傷模型組，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

7、3.硒對于氧化損傷肝細(xì)胞糖代謝酶的影響：損傷模型組細(xì)胞GK的mRNA和蛋白表達(dá)水平低于正常對照組，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，補(bǔ)硒組GK的mRNA和蛋白表達(dá)水平高于損傷組，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。損傷模型組細(xì)胞Akt的mRNA和蛋白表達(dá)水平低于正常對照組，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，補(bǔ)硒組Akt的mRNA和蛋白表達(dá)水平高于損傷組，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。損傷模型組GSK-3蛋白表達(dá)水平低于正常對照組，差別

8、有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，補(bǔ)硒組GSK-3蛋白表達(dá)水平與損傷組相比，差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。損傷模型組GS的mRNA表達(dá)水平低于正常對照組，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，補(bǔ)硒組細(xì)胞GS的mRNA表達(dá)水平高于損傷組差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。損傷模型組細(xì)胞ASK1的mRNA和蛋白表達(dá)水平高于正常對照組，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，補(bǔ)硒組細(xì)胞ASK1的mRNA和蛋白表達(dá)水平低于損傷模型組，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<

9、0.05)。 結(jié)論： 1.本研究采用不同濃度的H2O2誘導(dǎo)正常大鼠肝細(xì)胞(BRL)建立了氧化損傷的細(xì)胞模型，并通過細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察、MTT實(shí)驗(yàn)和抗氧化指標(biāo)的檢測進(jìn)行模型鑒定，確定了0.1mmol/L的H2O2為適合實(shí)驗(yàn)研究的損傷濃度。 2.觀察不同濃度的硒對氧化損傷的肝細(xì)胞模型的糖代謝關(guān)鍵酶GK、GS、GSK-3的影響。結(jié)果顯示，硒可以上調(diào)氧化損傷肝細(xì)胞GK的mRNA和蛋白表達(dá)水平，同時可以上調(diào)GSmRNA的表達(dá)水

10、平，提示硒可以在一定程度上改善氧化損傷對肝細(xì)胞糖代謝關(guān)鍵酶的影響。其可能的機(jī)制如下： 1.抗氧化途徑：硒通過提高氧化損傷肝細(xì)胞的SOD活力、增加細(xì)胞GSH-Px的mRNA表達(dá)水平和酶活性、降低細(xì)胞中MDA含量等作用，對氧化損傷的肝細(xì)胞起到一定的保護(hù)作用。 2.PI3K-Akt-GSK3途徑：硒通過提高胰島素信號傳導(dǎo)通路(PI3K-Akt-GSK3)中關(guān)鍵信號分子Akt的mRNA和蛋白表達(dá)的水平，進(jìn)而促進(jìn)了胰島素的信號傳導(dǎo)