MicroRNA126對人正常肝細(xì)胞葡萄糖代謝的影響.pdf

1、背景：
　　糖尿病是一種復(fù)雜的代謝紊亂性疾病，血糖代謝紊亂是其主要特征。研究表明，葡萄糖的代謝紊亂可能與高血糖代謝記憶、炎癥反應(yīng)以及線粒體功能異常有關(guān)，但有關(guān)糖尿病的具體發(fā)病機(jī)制，到目前仍不明確。
　　MicroRNAs（miRNAs）是一類序列短小的、進(jìn)化上高度保守的、非編碼的RNA，由20-25個單核苷酸組成。miRNAs通過與靶基因3’非編碼區(qū)結(jié)合，導(dǎo)致mRNA降解或直接抑制mRNA的翻譯，對基因轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行調(diào)控，從而參

2、與許多生理病理過程的精細(xì)調(diào)節(jié)。研究發(fā)現(xiàn)，miRNAs在細(xì)胞增殖和凋亡、炎癥反應(yīng)、信號傳導(dǎo)、細(xì)胞代謝以及腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起到至關(guān)重要的作用。大量的實(shí)驗(yàn)證據(jù)[1]表明，miRNAs在維持機(jī)體葡萄糖的穩(wěn)態(tài)和糖尿病的發(fā)展中有重要的調(diào)節(jié)作用。Anna Zampetaki等人發(fā)現(xiàn)在糖尿病患者的血漿中 microRNA126（miR-126）的相對表達(dá)量明顯降低，提出miR-126能準(zhǔn)確鑒別糖尿病高危者和健康人，可以作為糖尿病疾病發(fā)展的標(biāo)志物。同

3、時，我課題組在前期研究發(fā)現(xiàn)， miR-126在1型和2型糖尿病患者血漿中水平降低，其表達(dá)水平與炎癥反應(yīng)以及脂代謝紊亂等多種糖尿病危險因素相關(guān)。
　　肝臟是人體主要的葡萄糖代謝場所，在糖尿病的發(fā)生發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用。miR-126對人正常肝細(xì)胞葡萄糖代謝的具體作用如何呢？本研究針對改變chang liver細(xì)胞miR-126的表達(dá)量，以探討miR-126表達(dá)水平改變時對細(xì)胞胰島素反應(yīng)的敏感性和葡萄糖代謝的影響，以進(jìn)一步了解糖尿

4、病的發(fā)病機(jī)理。
　　材料和方法：
　　1．Chang liver細(xì)胞分為3組，正常對照組、negative control FAM（NC-FAM）組、microRNA inhibitor NC-FAM（IN-NC-FAM）組，分別用不同濃度10、20、40、80nM在lipofectamine2000（Lip2000)作用下轉(zhuǎn)染細(xì)胞，確定最佳轉(zhuǎn)染條件。
　　2．將chang liver細(xì)胞分為6組，分別為microRN

5、A126 mimic(miR-126)組、negative control（ NC）組、microRNA126 inhibitor(In-miR-126)組、microRNA inhibitor negative control（In-NC）組、lipofectamine2000（Lip2000）組和正常細(xì)胞對照組，按照上述優(yōu)化的轉(zhuǎn)染條件將對應(yīng)的人工合成的核苷酸序列轉(zhuǎn)染入相應(yīng)的細(xì)胞組。
　　3．實(shí)時熒光定量聚合酶聯(lián)反應(yīng)（qRT-P

6、CR）檢測各組細(xì)胞miR-126表達(dá)水平。
　　4．將步驟2中各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48h，用人工合成胰島素（100nM）刺激12小時，用GOD-POD法測上清葡萄糖濃度，BCA法測板下層細(xì)胞蛋白濃度，蒽酮法測定細(xì)胞糖原含量，乳酸測定試劑盒測定乳酸生成量，丙酮酸激酶測試盒測定丙酮酸激酶活力，用糖原含量/蛋白含量（μmol·mg-1）表示細(xì)胞糖原合成量；在乳酸作用下，用上清葡萄糖生成量/蛋白濃度（mmol·mg-1）的值表示細(xì)胞糖異生量

7、；在高糖環(huán)境（葡萄糖濃度11.1mmol/L）下，用乳酸生成量/蛋白濃度（mmol·mg-1）的值和丙酮酸激酶活力/蛋白濃度（U/gprot）表示細(xì)胞糖酵解量，從而觀察miR-126在正常肝細(xì)胞含量不同時，對細(xì)胞葡萄糖利用率、糖原合成、糖異生以及糖酵解作用的影響。
　　結(jié)果：
　　1．在無血清無抗生素的培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)染6小時，熒光顯微鏡下觀察，F(xiàn)AM標(biāo)記的無意對照序列（NC-FAM、IN-NC-FAM）能夠有效轉(zhuǎn)染人正常肝細(xì)胞

8、，且呈濃度依賴性，確定80nM為適宜轉(zhuǎn)染濃度。
　　2．qRT-PCR結(jié)果顯示：miR-126組與其他各組相比較，miR-126組miR-126相對表達(dá)量明顯高于其余的各實(shí)驗(yàn)組以及對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；In-miR-126組、NC組、In-NC組、lip2000組與正常對照組相比較miR-126的相對表達(dá)量變化無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。
　　3．將各核苷酸序列轉(zhuǎn)染至對應(yīng)細(xì)胞后，miR-126組較正常

9、對照組葡萄糖消耗量下降（33.66±2.55 vs59.12±4.03 P<0.05），糖原合成量明顯下降(4.35±0.33 vs8.42±0.56 P<0.05)，細(xì)胞乳酸生成量明顯下降(12.28±1.72 vs22.51±1.25 P<0.05)，丙酮酸激酶活力下降(120.87±26.23 vs277.39±57.60 P<0.05)，其余各組相比較差異不顯著；miR-126組與正常對照組相比糖異生量增加(17.05±0.88