高、低致病性PRRSV的分離鑒定和二重RT-PCR鑒別診斷方法的建立及應(yīng)用.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）是由豬繁殖和呼吸綜合征病毒（PRRSV）引起的一種傳染性疾病。根據(jù)PRRSV對(duì)感染豬致病力的強(qiáng)弱不同將其分為低致病性PRRSV毒株和高致病性PRRSV毒株。2006年7月以后，我國開始流行以Nsp2缺失30個(gè)氨基酸為特征的高致病性豬繁殖與呼吸綜合癥變異毒株（HP-PRRSV），為了對(duì)臨床上高、低致病性PRRSV進(jìn)行快速鑒別診斷，本研究進(jìn)行了高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒的分離鑒定和高、低致性PRRSV的二重

2、RT-PCR鑒別診斷方法，并進(jìn)行了推廣應(yīng)用試驗(yàn)。 方法：自不同地區(qū)和時(shí)期發(fā)生豬“高熱病”的規(guī)模化豬場病豬體內(nèi)分離鑒定PRRSV株，并對(duì)其他可能引起鍺“高熱病”的病原進(jìn)行檢測；選取其中1株純化的高致病性毒株進(jìn)行豬體攻毒試驗(yàn)。根據(jù)測序的高、低致病性PRRSV的NSP2基因主要差異特征設(shè)計(jì)共用下游引物和各自特異性的上游引物，建立了高、低致病性PRRSV的二重RT-PCR診斷方法，分別對(duì)該方法進(jìn)行了特異性、敏感性、重復(fù)性、應(yīng)用范圍、臨床

3、應(yīng)用實(shí)驗(yàn)及與其他方法的比較試驗(yàn)。選取采用本方法檢測結(jié)果為陽性的樣品同時(shí)采用Marc-145細(xì)胞進(jìn)行PRRSV的分離培養(yǎng)鑒定試驗(yàn)對(duì)照和國內(nèi)某單位所建立的高致病性豬藍(lán)耳病病毒RT-PCR診斷方法進(jìn)行比較實(shí)驗(yàn)。利用所建立的二重RT-PCR檢測方法對(duì)近2年來送檢的9376份（2007年4344、2008年5032）疑似PRRSV感染樣品結(jié)果進(jìn)行匯總分析。 結(jié)果：白發(fā)生豬“高熱病”的豬群共分離鑒定出8株P(guān)RRSV毒株，其Nsp2基因均存在

4、30個(gè)氨基酸缺失的特征，為豬“高熱病”的主要病原；對(duì)豬進(jìn)行攻毒試驗(yàn)可以復(fù)制出典型的豬藍(lán)耳病病毒變異株特征。成功建立了高、低致病性PRRSV的二重RT-PCR檢測方法，特異性試驗(yàn)表叫該檢測方法對(duì)8種對(duì)照病原核酸樣品及陰性對(duì)照樣品檢測結(jié)果均為陰性，對(duì)所有陽性對(duì)照樣品均擴(kuò)增出了相應(yīng)的目的條帶，說明該診斷方法特異性好；敏感件試驗(yàn)表明二重RT-PCR方法檢測的最低極限均為100個(gè)拷貝。對(duì)同一樣品進(jìn)行4次二重RT-PCR擴(kuò)增重復(fù)檢測實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果均

5、完全一致，表明該檢測方法具有好的重復(fù)件。應(yīng)用范圍試驗(yàn)表明所建立的方法對(duì)血清、全血、組織、鼻拭子等樣品均能進(jìn)行成功檢測，對(duì)來源于同一個(gè)體的不同樣品檢測結(jié)果表明血清樣品的PRRSV陽性檢出率稍高于全血、組織、鼻拭子拭等樣品，表明本所建立的方法可有效用于不同種類樣品中高致病性和低致病性PRRSV的鑒別診斷。本研究建立的二重RT-PCR檢測方法與其他檢測方法對(duì)多份樣品的符合試驗(yàn)結(jié)果陽性符合率均為100％。對(duì)近2年來送檢的9376份疑似豬“高熱病

6、”感染樣品檢測結(jié)果表明：PRRSV總平均陽性率43．04％，其中單HP-PRRSV平均陽性率為27．28％，單LP—PPRSV平均陽性率為9．01％，HP-PRRSV和LP-PRRSV平均雙陽性率為7．2，表明HP—PRRSV為近2年來發(fā)生“高熱病”豬群的主要病原之一。 結(jié)論：本研究成功分離鑒定了HP-PRRSV株，并證明了其對(duì)豬具有高致病性；建立了HP-PRRSV和LP-PRRSV二重RT-PCR鑒別診斷方法，該方法靈敏、特異