PRRSV nsp2形成aggresome的關(guān)鍵區(qū)域鑒定.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）是危害養(yǎng)豬業(yè)的重要病原之一，主要引起懷孕母豬的流產(chǎn)、早產(chǎn)和死胎等綜合繁殖障礙疾病，仔豬和育肥豬出現(xiàn)呼吸道綜合癥狀，對(duì)全球養(yǎng)豬業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。
　　聚合體（aggresome）作為病毒蛋白聚集場(chǎng)所和形式，為病毒復(fù)制和裝配提供豐富物質(zhì)基礎(chǔ)，同時(shí)能避免免疫系統(tǒng)的識(shí)別而不被降解，細(xì)胞蛋白14-3-

2、3是參與聚集體形成的重要蛋白之一。PRRSV非結(jié)構(gòu)蛋白nsp2由ORF1a編碼的具有復(fù)雜結(jié)構(gòu)域和功能的蛋白。前期研究的基礎(chǔ)發(fā)現(xiàn)，nsp2蛋白體外過(guò)表達(dá)后能發(fā)生聚集形成聚合體。為進(jìn)一步研究nsp2表達(dá)與聚集體形成的結(jié)構(gòu)區(qū)域，將nsp2蛋白進(jìn)行截?cái)啾磉_(dá)分析，尋找與聚集體形成有關(guān)的關(guān)鍵區(qū)域，為疫苗的設(shè)計(jì)提供理論依據(jù)。
　　根據(jù)nsp2蛋白結(jié)構(gòu)蛋白，將其分成半胱氨酸酶活性的結(jié)構(gòu)域、高變區(qū)、跨膜區(qū)及羧基端尾巴4段。分別克隆入帶有綠色熒光蛋白

3、（GFP）標(biāo)簽的真核表達(dá)載體。將構(gòu)建的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PRRSV易感細(xì)胞Marc-145，非易感細(xì)胞BHK-21細(xì)胞，用共聚焦顯微鏡觀察表達(dá)的nsp2蛋白形成aggresome情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)聚集體的形成與高變區(qū)及羧基端尾巴有關(guān)。前期的研究還發(fā)現(xiàn)，nsp2與14-3-3蛋白具有相互作用，14-3-3蛋白在聚合體形成過(guò)程中起著重要作用。用不同14-3-3不同亞型的抗體進(jìn)行共定位分析發(fā)現(xiàn)，nsp2與alpha/beta和epsilon亞型的14-

4、3-3蛋白具有相互作用。為進(jìn)一步研究聚集體形成的機(jī)制，將截?cái)啾磉_(dá)的nsp2蛋白分別轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞和Marc-145細(xì)胞，經(jīng)pull-down和Western blot分析發(fā)現(xiàn)，14-3-3與nsp2高變區(qū)具有相互作用，進(jìn)一步的共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)alpha/beta和epsilon亞型的14-3-3蛋白與nsp2的高變區(qū)及羧基端尾巴具有共定位作用。用抗14-3-3 alpha/beta亞型的抗體進(jìn)行免疫共沉淀，沉淀產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)譜分析，檢