Cry9Ea10突變體的構(gòu)建及與美國白蛾中腸結(jié)合蛋白的結(jié)合特征研究.pdf

1、蘇云金桿菌（Bacillus thuringiensis，Bt）Cry9Ea蛋白對(duì)入侵生物美國白蛾(Hyphantria cunea)具有較好的殺蟲活性。為了確定Cry9Ea蛋白與美國白蛾中腸結(jié)合蛋白相互作用中的關(guān)鍵區(qū)域和位點(diǎn)，本研究首次通過生物信息學(xué)分析選擇Cry9Ea10DomainⅢβ20-β21loop上的7個(gè)氨基酸殘基位點(diǎn)進(jìn)行丙氨酸掃描突變，獲得了殺蟲活性和親和力都發(fā)生變化的突變體，第一次克隆得到美國白蛾中腸類鈣黏蛋白基因，為

2、進(jìn)一步深入研究Cry9類蛋白殺蟲作用機(jī)理以及探索美國白蛾中腸受體功能提供了依據(jù)。
　　本研究從呈現(xiàn)細(xì)菌感染癥狀死亡的美國白蛾幼蟲體內(nèi)分離克隆得到了新的cry9Ea基因，國際Bt命名委員會(huì)正式命名為cry9Ea10，構(gòu)建了重組穿梭表達(dá)載體pSXY422b-9Ea10，電擊轉(zhuǎn)化Bt無晶體突變株HD73-，獲得工程菌HD（9Ea10），高效表達(dá)130kDa的Cry9Ea10蛋白，對(duì)美國白蛾幼蟲殺蟲活性LC50為8.02μg/mL。同時(shí)在

3、大腸桿菌BL21(DE3)中表達(dá)了Cry9Ea10DomainⅠ、DomainⅡ和DomainⅢ三個(gè)結(jié)構(gòu)域蛋白。利用在線分析工具和服務(wù)器對(duì)Cry蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)和二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析并建立了蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)預(yù)測模型，分析發(fā)現(xiàn)DomainⅢ上熱點(diǎn)殘基較為聚集，對(duì)比其它Cry9類蛋白結(jié)構(gòu)，Cry9Ea10DomainⅢ上的β20-β21loop呈現(xiàn)明顯差異。對(duì)β20-β21loop上的氨基酸殘基進(jìn)行丙氨酸掃描突變，獲得N601A、G602A、S60

4、3A、L604A、T605A、Y606A和E607A共7個(gè)突變子，均能產(chǎn)生130kDa的小球形晶體蛋白。
　　利用RACE-PCR方法獲得了美國白蛾中腸類鈣黏蛋白全長基因hccad-like（hccadherin-like），在HighFive細(xì)胞中表達(dá)約200kDa的HcCAD-like蛋白。同時(shí)對(duì)HcCAD-like蛋白N端Cadherin repeats CR1-CR5和近膜區(qū)Cadherin repeats CR6-MPR

5、功能域進(jìn)行了體外表達(dá)，Ligand Blot分析結(jié)果顯示，Cry9Ea10蛋白能夠與HcCAD-like特異結(jié)合，并且與CR6-MPR結(jié)合力較強(qiáng)，生物測定結(jié)果表明CR6-MPR可以增加Cry9Ea10蛋白對(duì)美國白蛾幼蟲的殺蟲活性?？寺〔⒈磉_(dá)了美國白蛾中腸氨肽酶N4基因hcapn4及其小片段基因hcapn-mv，Ligand Blot分析結(jié)果顯示，Cry9Ea10蛋白與HcAPN4特異結(jié)合并且結(jié)合區(qū)域位于GluZincin結(jié)構(gòu)域上的HcA

6、PN-MV。Cry9Ea10三個(gè)結(jié)構(gòu)域蛋白與中腸結(jié)合蛋白功能域的體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)表明DomainⅢ在與所有功能域結(jié)合中都起到重要作用。
　　對(duì)美國白蛾初孵幼蟲進(jìn)行生物活性測定，結(jié)果顯示N601A(LC50為15.84μg/mL)和G602A（LC50為14.41μg/mL）的殺蟲活性與野生型(LC50為9.40μg/mL)相比分別降低了69％和53％;S603A和T605A活性無明顯變化;L604A(LC50為3.73μg/mL)、Y

7、606A(LC50為2.87μg/mL)和E607A(LC50為2.12μg/mL)的殺蟲活性則分別提高了2.52、3.28和4.44倍。
　　7個(gè)突變子蛋白與美國白蛾中腸結(jié)合蛋白的親和能力分析結(jié)果顯示，N601A、G602A和S603A與HcCAD-like、CR1-CR5和CR6-MPR的親和力顯著降低;L604A與HcAPN4及其N端結(jié)構(gòu)域GluZincin的親和力顯著升高;Y606A與HcAPN4的結(jié)合力顯著升高;E607