棉鈴蟲Cry2Ab敏感毒力基線及中腸Cry2Ab結(jié)合蛋白和中腸酶液蛋白的分離和鑒定.pdf

1、第一代轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的商業(yè)化種植從1996年至今已經(jīng)超過了15年，為了延緩靶標(biāo)害蟲的抗性發(fā)展，兩種或兩種以上不同作用模式的Bt毒素基因被同時轉(zhuǎn)入作物中的第二代基因疊加轉(zhuǎn)基因棉花于2003年后推廣種植。應(yīng)用最廣泛的第二代抗蟲棉同時表達(dá)Cry1Ac和Cry2Ab兩種毒素，但在我國尚未種植這種雙價抗蟲棉。當(dāng)前對Bt毒素抗性的研究主要集中在Cry1A毒素上，對Cry2A毒素作用方式的研究還十分有限。
　　 本文通過對我國華北和西北兩個主要

2、棉花產(chǎn)區(qū)14個地點(diǎn)田間棉鈴蟲種群進(jìn)行Cry2Ab敏感性測定，建立了敏感基線;比較Cry1Ac和Cry2Ab毒素與棉鈴蟲抗性和敏感品系中腸BBMV蛋白結(jié)合特征和交互作用;通過蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，分離和鑒定棉鈴蟲中腸BBMV上Cry2Ab的主要結(jié)合蛋白，并測定了棉鈴蟲中腸液全蛋白。本文的研究結(jié)果將為棉鈴蟲Cry2Ab敏感性監(jiān)測和Cry2Ab抗性機(jī)理研究奠定重要基礎(chǔ)。
　　 1.棉鈴蟲Cry2Ab毒素敏感基線的建立
　　 2010

3、年棉鈴蟲對Cry2Ab毒素的敏感性監(jiān)測數(shù)據(jù)結(jié)果顯示:棉鈴蟲田間種群的LC50值分布在22-170ng/cm2之間，地區(qū)差異在10倍以內(nèi)。田間種群對Cry2Ab毒素和對Cry1Ac毒素敏感程度沒有明顯相關(guān)性。在監(jiān)測的全部14個地區(qū)，棉鈴蟲田間種群對Cry2Ab毒素敏感程度無明顯差異，說明第二代抗蟲棉可以在我國推廣種植并可望取得好的防效。
　　 2.Cry2Ab與棉鈴蟲Cry2Ab抗性和敏感品系中腸BBMV配基結(jié)合的比較
　　

4、 以生物素標(biāo)記的Cry2Ab毒素和棉鈴蟲中腸BBMV蛋白進(jìn)行配基結(jié)合實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)存在76、62、49、40、38、33kDa共6個結(jié)合條帶，在抗性品系中條帶76kDa和49kDa結(jié)合能力有明顯下降。在加入200倍未標(biāo)記的Cry2Ab毒素進(jìn)行同源競爭，所有條帶信號明顯減弱，說明這些條帶所在蛋白與Cry2Ab毒素結(jié)合具有飽和效應(yīng)，其結(jié)合能力下降可能是導(dǎo)致抗性的原因。對比Cry1Ac和Cry2Ab配基結(jié)合結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Cry1Ac結(jié)合蛋白至少超過

5、9種，在分子量從30到200kDa都有分布。與Cw1Ac結(jié)合的Cadherin條帶未在Cry2Ab的結(jié)合條帶中發(fā)現(xiàn)。在異源毒素競爭結(jié)合中，在200倍Cry2Ab毒素競爭條件下，幾乎對Cry1Ac的結(jié)合毫無影響;而200倍的Cry1Ac毒素的競爭條件下，足以取代所有Cry2Ab毒素，說明Cry2Ab毒素的結(jié)合方式和結(jié)合能力與Cry1Ac毒素有很大差異。
　　 3.棉鈴蟲中腸Cry2Ab結(jié)合蛋白和中腸液蛋白的分離和鑒定
　　

6、 通過2-DE、配基結(jié)合和質(zhì)譜鑒定相結(jié)合，分離和鑒定到32個Cry2Ab毒素的主要結(jié)合蛋白，分子量集中在30kDa到120kDa。在所鑒定的蛋白中有3種膜蛋白，分別是氨肽酶APN5、ATP/ADP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和膜聯(lián)蛋白Ⅸ。其中APN、ATP/ADP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白具備Cry1A毒素結(jié)合能力在先前研究中已有報道，而annexinⅨ在Cry2Ab毒素作用模式中的作用仍有待進(jìn)一步研究。此外，結(jié)合蛋白中還有大量代謝、細(xì)胞信號調(diào)控相關(guān)蛋白，它們結(jié)合的特異性以