RNA干擾技術(shù)抑制宮頸癌HeLa細(xì)胞IKCa1表達的研究.pdf

1、目的:探討鈣激活性中電導(dǎo)鉀離子通道(IKCal)的RNA干擾表達載體對宮頸癌HeLa細(xì)胞株IKCal基因和蛋白表達的抑制效果以及對HeLa細(xì)胞生物學(xué)特性的影響。方法:根據(jù)短發(fā)夾RNA(shRNA)設(shè)計原則,設(shè)計兩條針對IKCal基因的干擾序列和一條非特異性陰性對照序列,并將其定向克隆入真核表達載體 pGenesil-1.1中。得到三種質(zhì)粒 pGenesil-IK1(攜帶干擾序列1)、pGenesil-IK2(攜帶干擾序列2)、pGene

2、sil-HK(攜帶非特異性陰性對照序列),轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌DH5α,培養(yǎng)后提取質(zhì)粒；采用酶切、測序鑒定所提取質(zhì)粒。利用脂質(zhì)體法將構(gòu)建的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入宮頸癌 HeLa細(xì)胞中進行后續(xù)實驗。實驗共分4組:HeLa(空白對照)組、pGenesil-IK1組、pGenesil—IK2組、pGenesil-HK(陰性對照)組。轉(zhuǎn)染后48h提取各組細(xì)胞總RNA,以熒光定量PCR方法檢測轉(zhuǎn)染前后HeLa細(xì)胞株IKCal mRNA的變化。轉(zhuǎn)染后48h提取各組細(xì)

3、胞的總蛋白,以Western Blotting法檢測轉(zhuǎn)染前后IKCal蛋白表達情況,計算蛋白表達抑制率。利用WST-1檢測HeLa細(xì)胞增殖情況并繪制生長曲線。用流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期變化并計算細(xì)胞增殖指數(shù) PI。結(jié)果:經(jīng)酶切和測序鑒定顯示IKCal shRNA真核表達載體構(gòu)建成功。熒光定量PCR顯示:pGenesil-IK1組、pGenesil-IK2組 IKCal
　　 mRNA的表達較 pGenesil-HK組、HeLa組均

4、降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),但是 pGenesil-IK1組下降更顯著,能更好的抑制 IKCal mRNA表達。Western Blotting結(jié)果顯示:pGenesil-IK1組 IKCal蛋白表達水平比pGenesil—HK組、HeLa組低(P<0.05),pGenesil-IK2組與 pGenesil-HK組、HeLa組比較,IKCal蛋白表達降低不明顯(P>0.05)。pGenesil-IK1組的蛋白表達抑制率為36

5、.25％。WST-1檢測結(jié)果顯示,質(zhì)粒 pGenesil-IK1能有效抑制HeLa細(xì)胞增殖,與pGenesil-HK組、HeLa組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),pGenesil-HK對 HeLa細(xì)胞的增殖無影響(P>0.05)。流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期發(fā)現(xiàn),質(zhì)粒 pGenesil-IK1轉(zhuǎn)染 HeLa細(xì)胞后,G0/G1期細(xì)胞比率55.0±1.8％,S期細(xì)胞比率29.2±0.9％,與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。經(jīng)計算

6、細(xì)胞增殖指數(shù) PI后發(fā)現(xiàn):轉(zhuǎn)染了 pGensil-IK1質(zhì)粒的 HeLa細(xì)胞增殖指數(shù)為44.97±1.75％,而空白對照組(HeLa)和質(zhì)粒對照組(pGenesil-HK)增殖指數(shù)分別為50.2±0.1％,49.3±0.44％,均高于pGensil—IK1組,pGensil—IK1組與 pGenesil-HK組和 HeLa組差異具有顯著性(P＜0.05)。結(jié)論:所構(gòu)建的 IKCal shRNA真核表達載體pGenesil—IK1能有效地