二酰胺增強土木香內(nèi)酯誘導(dǎo)肺癌A549細胞凋亡的作用及機制.pdf

1、目的:肺癌是中國目前死亡率非常高的惡性腫瘤，發(fā)病率與死亡率均居于首位，超過胃癌和食管癌。在中國這樣的發(fā)展中國家，隨著環(huán)境的污染以及中國的吸煙人數(shù)位居世界之首都造成了肺癌在中國的發(fā)病率逐年上升。然而目前肺癌的治療方法仍不是十分理想，手術(shù)治療僅適用于早期肺癌，五年生存率僅有15％。在肺癌的發(fā)病中，非小細胞肺癌約占肺癌總敉的80-85％。臨床一線的化療藥物對非小細胞肺癌有效率僅有40％，且容易產(chǎn)生耐藥性。因此，開發(fā)新的化療藥物和用藥策略成為目

2、前肺癌治療的首要任務(wù)。
　　土木香是菊科多年生草本植物，土木香內(nèi)酯(Alantolactone，ALT)是土木香根莖中提取的有效成分。近年來在國內(nèi)外的研究中，土木香內(nèi)酯在宮頸癌、肝癌、乳腺癌，結(jié)直腸癌、腦膠質(zhì)瘤的治療中均有過明確的報道。在實驗室的前期研究中也首次發(fā)現(xiàn)了土木香內(nèi)酯可以通過氧化應(yīng)激作用誘導(dǎo)肺癌A549細胞凋亡，但需要使用大劑量才能完全誘導(dǎo)A549細胞凋亡，劑量需達到40μM。于是，在進一步的研究中力求探索一種同樣具有對

3、細胞造成氧化損傷的藥物與土木香內(nèi)酯共同應(yīng)用以加強土木香內(nèi)酯的抗肺癌作用。
　　二酰胺(Diamide)是一種巰基氧化劑，國內(nèi)外研究以明確報道它能特異性地氧化還原型谷胱甘肽(GSH)，降低細胞內(nèi)GSH過氧化物酶活性，引發(fā)細胞內(nèi)的過氧化損傷。但單獨應(yīng)用二酰胺對細胞造成氧化損傷的IC50濃度需達到2mM。
　　綜上所述，本實驗主要探索二酰胺是否可以通過誘發(fā)細胞內(nèi)氧化損傷作用，在與土木香內(nèi)酯共同應(yīng)用時加強土木香內(nèi)酯誘導(dǎo)肺癌A549細

4、胞凋亡的效應(yīng)，且兩種藥物都不用使用較大劑量就可以達到很好的誘導(dǎo)凋亡作用，為臨床肺癌化療提供新的用藥策略。
　　方法:1、體外培養(yǎng)非小細胞肺癌A549細胞。2、MTT實驗檢測二酰胺與土木香內(nèi)酯共同用藥時A549細胞的增殖能力。3、光學(xué)顯微鏡觀察二酰胺與土木香內(nèi)酯共同用藥時A549細胞的形態(tài)變化。4、細胞生存死亡形成實驗(Live/dead assay)檢測二酰胺與土木香內(nèi)酯共同用藥時A549細胞的死亡比例。5、Hoeshst3325

5、8凋亡細胞核染色實驗檢測二酰胺與土木香內(nèi)酯共同用藥時A549細胞的凋亡數(shù)量。6、流式細胞術(shù)Annexin V-FITC/PI雙染色法檢測二酰胺與土木香內(nèi)酯共同用藥時A549細胞的凋亡比例。7、細胞內(nèi)活性氧(ROS)檢測試劑盒檢測二酰胺與土木香內(nèi)酯共同用藥時A549細胞的活性氧生成量。8、細胞內(nèi)線粒體膜電位(MMP)檢測試劑盒檢測二酰胺與土木香內(nèi)酯共同用藥時A549細胞的線粒體膜電位。9、細胞內(nèi)還原性谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽(GSH/GS

6、SG)檢測試劑盒檢測二酰胺與土木香內(nèi)酯共同用藥時A549細胞的還原型谷胱甘肽、氧化型谷胱甘肽以及GSSG/GSH的比值。10、Western blotting法檢測二酰胺與土木香內(nèi)酯共同用藥時A549細胞的STAT3信號通路相關(guān)蛋白STATA3、P-STAT3、SHP-1、Bax、Bcl-2、Cl-caspase-3、CI-PARP、JAK2、P-JAK2、PTEN等的表達。
　　結(jié)果:1、MTT結(jié)果顯示二酰胺增強土木香內(nèi)酯抑制A

7、549細胞增殖的作用。2、光學(xué)顯微鏡觀察到:與對照組相比，二酰胺增強土木香內(nèi)酯對A549細胞的形態(tài)改變。3、細胞生存死亡形成實驗、流式細胞術(shù)實驗、.Hoeshst33258凋亡細胞核染色實驗證實二酰胺增強土木香內(nèi)酯誘導(dǎo)A549細胞凋亡比例。4、細胞內(nèi)活性氧檢測試劑盒、細胞內(nèi)線粒體膜電位檢測試劑盒、細胞內(nèi)GSH和GSSG檢測試劑盒檢測結(jié)果表明:與對照組相比，二酰胺增強土木香內(nèi)酯對A549細胞內(nèi)活性氧生成的提升，線粒體膜電位的降低，GSSG