機(jī)械牽張力與氧化型低密度脂蛋白協(xié)同促進(jìn)大鼠血管平滑肌細(xì)胞脂質(zhì)攝取和MAPKs激活的研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、目的: 用機(jī)械牽張力(stretch stress)和/或氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein,oxLDL)刺激大鼠血管平滑肌細(xì)胞(Rat vascular smooth muscle cells,RVSMCs),研究機(jī)械牽拉力對RVSMCs攝取oxLDL的影響及其分子機(jī)制,探討高血壓與高血脂協(xié)同促進(jìn)動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)發(fā)生的機(jī)制。 實(shí)驗(yàn)方法

2、: (1)體外分離大鼠主動脈中膜,組織塊貼壁法原代培養(yǎng)RVSMCs,并進(jìn)行形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)鑒定(分別用光鏡和Western blot的方法)。 (2)高速離心法分離血漿中的LDL(native LDL,nLDL),用硫酸銅對其進(jìn)行氧化,獲得oxLDL;用瓊脂糖凝膠電泳鑒定分離的nLDL和oxLDL。 (3)用nLDL和oxLDL分別培養(yǎng)RVSMCs一定時間后用油紅染色檢測細(xì)胞對脂質(zhì)的攝取,用MTT的辦法檢測細(xì)胞活

3、性。 (4)不同濃度的nLDL、oxLDL、機(jī)械牽張力分別作用于RVSMCs,用Western blot的方法進(jìn)一步檢測MAPKs的激活; (5)用oxLDL和機(jī)械牽張力共同作用于RVSMCs,Western blot的方法檢測MAPKs的磷酸化水平的變化。并利用總膽固醇試劑盒檢測細(xì)胞的總膽固醇含量。 結(jié)果: (1)7天左右有細(xì)胞從組織塊中長出,14天鋪滿培養(yǎng)瓶。細(xì)胞呈長梭型和谷峰樣的外觀,細(xì)胞表達(dá)平滑肌

4、特異抗原α—actin。 (2)離心后,LDL與血漿其他成分分界清晰,蛋白定量檢測顯示LDL的濃度較高,瓊脂糖電泳顯示LDL在血漿β脂蛋白對應(yīng)處,且條帶單一,oxLDL的遷移率明顯高于nLDL; (3)油紅染色顯示nLDL和oxLDL可以誘導(dǎo)RVSMCs細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)含量增加;10-200μg/ml的nLDL和oxLDL均可使RVSMCs的活性增高,但是相同濃度的oxLDL的作用強(qiáng)于nLDL的作用。 (4)Weste

5、rn blot顯示:機(jī)械牽拉力和oxLDL均可以導(dǎo)致MAPKs的磷酸化,而oxLDL和機(jī)械牽張力可以協(xié)同促進(jìn)細(xì)胞MAPKs的磷酸化。 (5)總膽固醇實(shí)驗(yàn)顯示:oxLDL以及機(jī)械牽拉力可以分別提高RVSMCs總膽固醇的濃度,而機(jī)械牽張力與oxLDL共同作用可協(xié)同促進(jìn)RVSMCs對總膽固醇的攝取,亦即:細(xì)胞內(nèi)總膽固醇濃度大于單獨(dú)oxLDL或機(jī)械牽張力刺激的RVSMCs細(xì)胞總膽固醇的濃度。 結(jié)論:機(jī)械牽張力和oxLDL可分別促

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