HBV cccDNA特異性定量檢測方法篩選優(yōu)化及應(yīng)用研究.pdf

1、乙型肝炎病毒(HBV)共價閉合環(huán)狀DNA(covalentlyclosedcircularDNA，cccDNA)是HBV復(fù)制早期即開始合成一種中間體，由cccDNA反轉(zhuǎn)錄形成pgRNA及其他一系列RNA，開始病毒的復(fù)制增殖，cccDNA存在及數(shù)量標(biāo)志著HBV的復(fù)制和復(fù)制的活躍程度。cccDNA的檢測在HBV清除機制研究、抗HBV藥物機制及藥效學(xué)研究、對不同的乙型肝炎患者病情變化的監(jiān)測均有重要的應(yīng)用價值。但由于其結(jié)構(gòu)上和生物學(xué)方面的特殊性

2、，cccDNA特異性檢測一直存在較大的難度。自二十世紀(jì)90年代初，不斷有學(xué)者發(fā)明新的cccDNA特異性檢測方法，但均未能推廣。另外，目前有關(guān)cccDNA的研究數(shù)據(jù)大多通過鴨、土撥鼠、黑猩猩等實驗動物模型和細胞模型中獲得，而直接從慢性乙型肝炎患者等臨床病人中獲得的資料仍然比較缺乏。本課題從目前有關(guān)cccDNA特異性檢測方法中篩選幾種可能性比較大的方法進行驗證，將能確切提高cccDNA檢測特異性和靈敏度的方法進行優(yōu)化，作為一種方法的幾個步驟

3、組合起來，并用此方法檢測肝移植術(shù)后不同時期患者的外周血單個核白細胞(peripheralbloodmononuclearcell，PBMC)及慢性乙型肝炎患者的PBMC和肝組織穿刺標(biāo)本。 本課題分為三個部分：一、HBVcccDNA特異性檢測方法的篩選及優(yōu)化；二、慢性乙型肝炎患者PBMC及肝組織中HBVcccDNA定量檢測；三、肝移植患者外周血單個核細胞中HBV檢測及臨床意義。 一、HBVcccDNA特異性檢測方法的篩選及

4、優(yōu)化目的對目前幾種cccDNA特異性檢測方法進行篩選，選擇能更好地提高cccDNA檢測特異性的幾個方法組合起來，并將此組合的方法進行優(yōu)化完善。方法根據(jù)文獻報道，選擇理論上可以提高cccDNA檢測特異性的幾種方法：十二烷基硫酸鉀(potassiumdodecylsulfate，PDS)-蛋白質(zhì)沉淀核酸抽提法，嵌合引物(chimericprimer)cccDNA特異性檢測法，特異性核酸酶切法，跨rcDNA缺口的PCR擴增法和實時熒光PCR法

5、等，以慢性乙型肝炎患者血清、肝組織標(biāo)本及HBV質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品鑒定、選擇最佳的幾個方法，作為分步驟組合為一個新的方法，再對每個步驟進行優(yōu)化，提高檢測方法的特異性、靈敏度和穩(wěn)定性。結(jié)果抽提HBV核酸后，先用不降解質(zhì)粒的ATP依賴DNA酶(Plasmid-SafeATP-dependentDNase，PSAD)特異性切除非cccDNA核酸，再以跨rcDNA缺口的熒光PCR定量法檢測，10份HBVrcDNA高滴度(107拷貝/m1)血清均未出現(xiàn)cc

6、cDNA假陽性結(jié)果，用HBV質(zhì)粒驗證其靈敏度可達103拷貝/ml，并且cccDNA的檢測可與總HBVDNA及β-actin采用相同的熒光PCR退火溫度。結(jié)論該方法定量檢測HBVcccDNA，特異性高，敏感性較好，與總HBVDNA及β-actin同時檢測可減少誤差。 定量檢測二、慢性乙型肝炎患者PBMC及肝組織中HBVcccDNA定量檢測 目的觀察HBVcccDNA在慢性乙型肝炎患者PBMC及肝組織中的存在及分布情況。方法

7、標(biāo)本抽提核酸后，以PSAD進行酶切，再以跨雙缺口的特異性引物進行熒光PCR定量檢測HBVcccDNA；取慢性乙型肝炎患者PBMC和肝組織穿刺標(biāo)本各50份，檢測其總HBVDNA和cccDNA。結(jié)果所有肝組織中總HBVDNA和cccDNA檢測均陽性，總HBVDNA含量為3.19×102～6.69×107拷貝/μg人基因組DNA，cccDNA含量為7.32×100～6.51×106拷貝/μg人基因組DNA，同一患者肝組織中總HBVDNA含量是

8、cccDNA含量的10.7倍至9.2×105倍。結(jié)論PBMC不能支持HBV的復(fù)制。在慢性乙肝患者的肝組織中均可檢測到cccDNA，但其水平并非與細胞內(nèi)總HBVDNA水平正相關(guān)，是否有其它影響因素如患者免疫狀態(tài)、病情輕重等值得進一步研究。 三、肝移植患者外周血單個核細胞中HBV檢測及臨床意義 目的研究乙肝肝硬化終末期患者肝移植后外周血單個核細胞(PBMC)HBVDNA狀態(tài)及臨床意義。方法應(yīng)用熒光定量PCR技術(shù)定量檢測乙肝肝

9、硬化終末期肝移植術(shù)后30例患者血清及PBMC標(biāo)本HBVDNA，并用細胞計數(shù)法和管家基因β-actin標(biāo)定PBMCHBVDNA，觀察PBMCHBVDNA與血清HBVDNA定量關(guān)系；觀察患者肝移植術(shù)后不同時間PBMCHBVDNA水平。30例對照組為肝炎肝硬化失代償期患者。結(jié)果移植后患者19份(63％)PBMC標(biāo)本HBVDNA陽性，低于對照組(87％，26/30)。以Ct值為定量參數(shù)，移植后患者PBMCHBVDNA水平顯著低于對照組(P=0.

10、02)；肝移植術(shù)后患者PBMCHBVDNA長期維持于103～104拷貝/106細胞水平，與肝移植后時間無明顯關(guān)系。移植后患者血清HBVDNA均陰性，而對照組血清陽性率為48％。結(jié)論乙肝肝硬化終末期患者肝移植術(shù)后，經(jīng)過有效的預(yù)防HBV再感染治療后，雖然血清中不能測出HBVDNA，但相當(dāng)長的一段時間里，PBMC中仍能檢出HBV，提示在血細胞生活周期的某個階段，或是在血細胞發(fā)育環(huán)境中如骨髓中的造血細胞或組織細胞中，可能存在HBV肝外復(fù)制形式并