HBV cccDNA滾環(huán)擴增檢測方法的建立.pdf

1、目的:乙型肝炎病毒共價閉合環(huán)狀DNA(HBV cccDNA)是HBV基因復(fù)制和合成的模板，也是抗病毒治療結(jié)束后乙型肝炎復(fù)發(fā)的主要原因。本研究旨在建立滾環(huán)擴增(Rolling Cycle Amplification，RCA)方法，檢測HBV cccDNA，研究此方法的特異性及敏感性，探索其臨床意義及應(yīng)用價值。
　　 方法:以HBV全基因質(zhì)粒為模板，經(jīng)酶切、連接、濃縮、膠回收純化等步驟，構(gòu)建和制備HBV cccDNA標(biāo)準(zhǔn)品，作為研究

2、中的陽性對照DNA模板。用Qiagen試劑盒抽提慢性乙型肝炎患者肝組織標(biāo)本總DNA，并經(jīng)Plasmid SafeTM ATP dependent Danse(PSAD)酶處理，以此為模板，進行滾環(huán)擴增。用HBV cccDNA標(biāo)準(zhǔn)品、3.2Kb線性HBV DNA、正常肝組織及15例慢性乙型肝炎患者血清作為對照，分別以瓊脂糖凝膠電泳和Southern Blot印跡核酸雜交兩種方法驗證此方法的特異性。將HBV cccDNA標(biāo)準(zhǔn)品進行系列稀釋，

3、了解該方法的敏感性。
　　 結(jié)果:本研究成功構(gòu)建了HBV cccDNA，并可用RCA方法進行擴增；RCA方法可從少至2mg的慢性乙型肝炎患者的肝組織中檢測到HBV cccDNA；該方法可檢測低至102拷貝的HBV cccDNA分子；RCA方法不能檢測3.2Kb線性HBV DNA；在正常肝組織及15例乙肝患者血清中檢測不到HBV cccDNA。
　　 結(jié)論：RCA方法操作較方便,具有很高的特異性和敏感性，可為肝細(xì)胞核內(nèi)HB