Ezrin在小鼠附植前胚胎中的表達(dá)規(guī)律及功能.pdf

1、Ezrin在上皮細(xì)胞極化過程中發(fā)揮著重要作用，同時對細(xì)胞粘附、細(xì)胞遷移、細(xì)胞增殖、細(xì)胞信號傳導(dǎo)和細(xì)胞形態(tài)的維持等多種生命活動均起到重要調(diào)節(jié)作用。磷酸化修飾是調(diào)控Ezrin活性最重要的機(jī)制。目前已鑒定的調(diào)節(jié)Ezrin功能的磷酸化位點(diǎn)有7個。已有的研究表明小鼠卵母細(xì)胞及附植前胚胎中都有Ezrin表達(dá)，并且存在Tyr及其他氨基酸殘基的磷酸化修飾，但究竟是哪些位點(diǎn)發(fā)生了磷酸化？其在胚胎發(fā)育中的意義是什么？目前不得而知。本論文研究了Ezrin在小

2、鼠早期胚胎中的表達(dá)、修飾及定位規(guī)律，探討Ezrin對小鼠早期胚胎發(fā)育的影響，為進(jìn)一步研究附植前胚胎發(fā)育提供了一定理論依據(jù)。
　　本試驗(yàn)利用熒光定量PCR、間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)研究了ezrin在小鼠早期胚胎中的表達(dá)、修飾及定位規(guī)律，并采用siRNA干擾手段研究了ezrin對小鼠早期胚胎發(fā)育的影響。試驗(yàn)分為以下3個部分：
　　1、小鼠附植前胚胎中ezrin表達(dá)規(guī)律
　　收集小鼠附植前各時期胚胎，提取總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，以act

3、in為內(nèi)參基因，以實(shí)時熒光定量PCR方法研究小鼠早期胚胎ezrin表達(dá)規(guī)律，發(fā)現(xiàn)：從原核期向囊胚發(fā)育過程中小鼠胚胎內(nèi) ezrin相對表達(dá)量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。在2-C期，ezrin mRNA相對表達(dá)量達(dá)到最大，極顯著高于其他發(fā)育階段的胚胎（P＜0.01），之后，隨著胚胎發(fā)育而迅速直線下降，到8-C期達(dá)到最低水平，隨后又逐漸上升，但從桑椹胚向囊胚發(fā)育時，ezrin相對表達(dá)量以再次下降。
　　2、小鼠附植前胚胎中ezrin的修飾及

4、定位規(guī)律
　　收集小鼠從原核期到囊胚期不同發(fā)育階段的胚胎，用ezrin抗體及p-ezrin(Tyr354)及 p-ezrin(Thr567)抗體進(jìn)行間接免疫熒光染色，觀察小鼠早期胚胎內(nèi) ezrin磷酸化修飾情況及定位規(guī)律。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：1）在原核期和2-細(xì)胞期胚胎中，ezrin主要定位在胞質(zhì)；而從4-C到桑椹胚期，ezrin在胞質(zhì)、胞核中均有定位；在囊胚期，ezrin則主要定位在細(xì)胞皮層區(qū)域；2）從原核期到囊胚期小鼠胚胎內(nèi) ezrin

5、均有部分分子發(fā)生了Tyr354磷酸化修飾，并且除原核期胚胎外，p-ezrin(Tyr354)均在細(xì)胞核內(nèi)有明顯富集；3）從原核期到囊胚期小鼠胚胎內(nèi)ezrin均有Thr567磷酸化修飾；在原核期胚胎和桑椹胚，p-ezrin(Thr567)主要定位在皮層區(qū)，尤其是在桑椹胚外層細(xì)胞的頂膜皮層定位最多；在2-細(xì)胞期，p-ezrin(Thr567)在卵裂球的胞質(zhì)和皮層區(qū)均有分布，但在細(xì)胞接觸處明顯富集；而在4-細(xì)胞及8-細(xì)胞期胚胎中，p-ezri

6、n(Thr567)除在胞間連接處富集外，在核內(nèi)也有明顯富集；在囊胚期，p-ezrin(Thr567)主要在細(xì)胞核和細(xì)胞皮層區(qū)中富集。
　　3、Ezrin在小鼠早期胚胎發(fā)育中的功能
　　收集小鼠原核期胚胎平均分成2組，試驗(yàn)組注射驗(yàn)證過的ezrin siRNA，對照組注射陰性 siRNA，比較兩組間胚胎發(fā)育效率及囊胚細(xì)胞總數(shù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：試驗(yàn)組2-細(xì)胞期、4-細(xì)胞期及8-細(xì)胞期胚胎發(fā)育率均與對照組相似，桑椹及囊胚發(fā)育率則明顯低于對