GRIM-19在小鼠植入前胚胎中表達(dá)及作用的研究.pdf

1、目的：
　　 線粒體是卵胞質(zhì)中含量最為豐富的細(xì)胞器，其產(chǎn)生的ATP是卵子、受精卵以及胚胎主要的能量來(lái)源。研究證明在胚胎早期發(fā)育過(guò)程中，線粒體經(jīng)歷了一系列形態(tài)和位置的改變，其中，線粒體的結(jié)構(gòu)尤其內(nèi)膜的各種成分與線粒體的功能密切相關(guān)，因此，在此期間線粒體的功能狀態(tài)改變直接影響植入前胚胎的生長(zhǎng)和增殖。如果線粒體呼吸鏈?zhǔn)軗p，使得ATP產(chǎn)生減少，還能導(dǎo)致非整倍體的發(fā)生，并干擾正常的受精及胚胎發(fā)育而影響卵子的發(fā)育潛能。
　　 干擾素

2、/維甲酸聯(lián)合應(yīng)用誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因(gene associated with retinoid-interferon-induced mortality-19，GRIM-19)是線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ的一部分，其對(duì)線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ-Ⅳ的裝配及線粒體呼吸鏈的電荷轉(zhuǎn)移和電化學(xué)勢(shì)能的維持都是必需的，GRIM-19缺乏會(huì)導(dǎo)致線粒體結(jié)構(gòu)、分布、以致功能的異常。研究顯示，缺乏GRIM-19的小鼠胚胎在9.5天死亡，提示GRIM-19在胚胎發(fā)育中

3、起著非常關(guān)鍵的作用，并且GRIM-19在心臟的早期發(fā)育中也起著重要的作用。目前尚無(wú)GRIM-19在植入前胚胎中表達(dá)情況的研究報(bào)道，GRIM-19在早期胚胎有何作用及作用機(jī)制仍不清楚。本研究通過(guò)檢測(cè)GRIM-19基因在小鼠植入前胚胎的表達(dá)，觀察GRIM-19在植入前胚胎的動(dòng)態(tài)表達(dá)情況，探討GRIM-19對(duì)早期胚胎生長(zhǎng)發(fā)育的作用。
　　 方法：
　　 1、小鼠超排卵及胚胎獲取
　　 雌性性成熟昆明系小鼠，腹腔注射HM

4、G10IU/只，48h后腹腔注射hCG10IU/只，與性成熟雄性昆明系小鼠按1∶1比例合籠過(guò)夜。次日晨檢查雌鼠陰栓，陰栓陽(yáng)性的（hCG后27h）脫頸法處死雌鼠，取雙側(cè)輸卵管，在實(shí)體顯微鏡下，取出受精卵，轉(zhuǎn)入四孔皿，每孔中加入400μl預(yù)先在培養(yǎng)箱中平衡的G1培養(yǎng)液，覆蓋礦物油，37℃、5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)備用。分別在注射hCG后的46-48h、55h、65h、75h、84-86h取2-細(xì)胞、4-細(xì)胞、8-細(xì)胞、桑葚胚及囊胚期的胚胎。<

5、br>　　 2、胚胎分級(jí)
　　 8-細(xì)胞胚胎分級(jí)標(biāo)準(zhǔn):1級(jí)，卵裂球等大、均質(zhì)透明、無(wú)碎片;2級(jí)，卵裂球不完全等大、均質(zhì)透明、無(wú)碎片;3級(jí)，卵裂球等大、均質(zhì)但有少數(shù)碎片存在于卵間隙中;4級(jí)，卵裂球不等大、有碎片、顆粒不均變黑等。因有些級(jí)別的胚胎數(shù)太少為便于統(tǒng)計(jì)將1，2，3級(jí)胚胎列為優(yōu)胚組（A組），4級(jí)為非優(yōu)胚組（B組）。
　　 3、Western blot
　　 分別將收集到的各期胚胎（500個(gè)）用PBS沖洗1-

6、2次，加入20μl蛋白提取緩沖液，在超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)下超聲20次(130watt，20khz，5s)。加入SDS樣品緩沖液，100℃煮沸5min，SDS-PAGE電泳分離后將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5％奶粉封閉，然后與兔抗鼠IgG/GRIM-19抗體(1∶500)，兔抗鼠β-actin抗體(1∶4000)4℃孵育過(guò)夜。辣根過(guò)氧化物酶(HRP)偶聯(lián)的羊抗兔IgG作為二抗(1∶5000)，常溫孵育1h。ECL化學(xué)發(fā)光法顯色，膠片于暗室中曝光。

7、用ImageJ軟件獲得各條帶光密度值，以目的基因與內(nèi)參β-actin比值表示其含量。
　　 4、Real-time PCR
　　 i.配置胚胎裂解液和逆轉(zhuǎn)錄液（50μl體系，冰上配制）2μlNP-40，1μlRRI(Ribonuclease Inhibitor),10μl5×prime ScriptTM Buffer(for Real Time),2.5μl Oligo dt Primer(50μM)×1,5μlRand

8、om 6 mers(100μM),22μlRnase Free dH2O。
　　 ii.胚胎的裂解通過(guò)上述方法獲取的各期胚胎，用Tyrode's酸去除透明帶，經(jīng)PBS沖洗，在體視鏡下用微吸管吸取20個(gè)卵裂球，吸入體積控制在5μl以內(nèi)，分別加至已含細(xì)胞裂解液的無(wú)RNA酶的PCR管中，空白對(duì)照管中加入無(wú)細(xì)胞的等量PBS。放置冰上2h，充分裂解細(xì)胞。
　　 iii.逆轉(zhuǎn)錄向上述各PCR管中加入3μl Prime ScriptT

9、M RT Enzyme MixⅠ混勻，反應(yīng)條件:第一步，37℃ 20min，第二步，85℃ 5sec，第三步，12℃ forever，第四部，stop。
　　 iv.Real Time PCR(20μl體系)10μl SYBRP remix Ex TagTM,0.2μl PCR F Primer，0.2μlPCR R Primer，2.0μlcDNA模板，7.6μl3dw滅菌。反應(yīng)條件:95℃30sec，Holding stag

10、e;95℃ 5sec，60.0℃ 30sec，40 cycles;95.0℃ 15sec,60.0℃ 1min,90℃ 15sec,Melt curve stage。
　　 5、顯微注射抗體
　　 小鼠促排卵獲取受精卵（如上所述），隨機(jī)分為兩組，a組（注射抗體組）使用顯微注射技術(shù)將抗GRIM-19抗體注射至受精卵胞質(zhì)中，b組（空白對(duì)照組）將等量的G1培養(yǎng)液注射至受精卵胞質(zhì)中，觀察受精卵的發(fā)育情況。
　　 結(jié)果：<

11、br>　　 1、GRIM-19蛋白在小鼠植入前各期胚胎中均有表達(dá)，其蛋白水平從2-細(xì)胞期逐漸增高，至8-細(xì)胞期達(dá)高峰，隨后呈下降趨勢(shì)，至囊胚期達(dá)到最低。
　　 2、GRIM-19mRNA轉(zhuǎn)錄水平從2-細(xì)胞期逐漸增高，至8-細(xì)胞期達(dá)高峰，隨后呈下降趨勢(shì)，至囊胚期達(dá)到最低。
　　 3、8-細(xì)胞胚胎中的優(yōu)胚組GRIM-19mRNA水平明顯高于非優(yōu)胚組(P＜0.05)。
　　 4、顯微注射抗GRIM-19抗體組胚胎的成

12、活率低于對(duì)照組，并且相對(duì)于對(duì)照組胚胎，實(shí)驗(yàn)組胚胎的生長(zhǎng)發(fā)育受到不同程度的阻滯，胚胎不能正常發(fā)育至囊胚階段。
　　 結(jié)論：
　　 1、GRIM-19在小鼠植入前胚胎中持續(xù)表達(dá)，其表達(dá)量隨發(fā)育時(shí)程的變化而改變，提示GRIM-19在早期胚胎發(fā)育過(guò)程中具有一定的作用，并隨胚胎增殖進(jìn)程而有所變化，其中具體的機(jī)制有待更深入的研究。
　　 2、GRIM-19的表達(dá)量與胚胎分級(jí)正相關(guān)，說(shuō)明GRIM-19的表達(dá)與胚胎質(zhì)量及發(fā)育潛能