Rho家族C-末端肽對樹突狀細(xì)胞交叉遞呈的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、經(jīng)典的抗原遞呈理論認(rèn)為，抗原遞呈細(xì)胞(antigenpresentingcell，APC)在加工處理和遞呈外源性抗原及內(nèi)源性抗原時(shí)存在兩種不同的途徑，即分別為MHCⅡ類分子限制性途徑和MHCⅠ類分子限制性途徑。然而研究發(fā)現(xiàn)，外源性抗原經(jīng)APC攝取、加工處理后，可與MHCⅠ類分子結(jié)合形成復(fù)合物，呈遞到APC表面，進(jìn)而活化CD8+T細(xì)胞，這種現(xiàn)象被稱為交叉遞呈。大量研究表明，顆粒性抗原、可溶性抗原等多種抗原都可以經(jīng)過交叉遞呈途徑有效活化CT

2、L應(yīng)答。交叉遞呈在機(jī)體抵抗感染非APC的病毒和其它病原微生物、誘導(dǎo)抗腫瘤免疫及維持外周耐受等方面都發(fā)揮著重要作用。樹突狀細(xì)胞(dendriticcells，DC)是體內(nèi)最有效的專職APC，也是執(zhí)行交叉遞呈功能的主要細(xì)胞。 DC需要經(jīng)歷由不成熟向成熟階段的轉(zhuǎn)變才能有效刺激T細(xì)胞活化。DC成熟過程中抗原攝取能力下降，同時(shí)伴隨細(xì)胞表型及細(xì)胞形態(tài)的改變。所有這些變化均與受RhoGTPases家族調(diào)控的肌動蛋白細(xì)胞骨架重排關(guān)系密切。Rho

3、家族由至少23個(gè)成員組成，其中以RhoA，Racl和Cdc42研究最為廣泛。近年來研究發(fā)現(xiàn)，Rho家族蛋白在DC的形態(tài)、內(nèi)吞作用、遷移以及MHCⅡ類分子限制性遞呈和交叉遞呈中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。DC成熟過程中內(nèi)吞能力的下降與Cdc42活化水平的下調(diào)密切相關(guān)；活化型Cdc42和。RhoA可增強(qiáng)DC的MHCⅡ類分子限制性遞呈；抑制Racl可以減少DC對凋亡細(xì)胞的吞噬及交叉遞呈。 Rho家族成員雖然功能各不相同，但卻具有高度的同源性

4、，各成員間最主要的差別在于其高變的C-末端多堿基區(qū)，且研究認(rèn)為C-末端多堿基區(qū)在RhoGTPases生理功能的發(fā)揮中起著關(guān)鍵性作用。Racl通過其C-末端多堿基區(qū)不僅可以結(jié)合并活化絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶PAK，而且還可活化中性粒細(xì)胞NADPH氧化酶。此外，Rac2的C-末端多堿基區(qū)也是Rac2在細(xì)胞內(nèi)的定位及細(xì)胞增殖、遷移等多種功能的發(fā)揮所必需的。以往研究利用Tat穿膜肽能夠快速、高效的將Rho家族成員C-末端多堿基區(qū)帶入細(xì)胞，并與下游

5、信號通路中某些特定效應(yīng)蛋白直接結(jié)合的特性，研究C-末端多堿基區(qū)在Rho家族蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞功能中的作用?；诖?，我們希望利用Tat穿膜肽與Rho家族不同成員C-末端多堿基區(qū)構(gòu)成的融合肽，通過觀察其對DC交叉遞呈的影響來研究Rho家族不同成員C-末端多堿基區(qū)在DC交叉遞呈中的作用。 首先，本研究設(shè)計(jì)合成了6條由Tat穿膜肽和Rho家族不同成員C-末端多堿基區(qū)構(gòu)成的融合肽，包括Tat-Racl、Tat-hRac2、Tat-mRac2、

6、Tat-Rac3、Tat-RhoA和Tat-Cdc42C-末端融合肽，以及Tat對照肽，進(jìn)而以表達(dá)dsRed-OVA144-386融合蛋白的大腸桿菌(E.coliBL21/pYOVA)為抗原，在成功建立DC2.4細(xì)胞抗原交叉遞呈分析平臺的基礎(chǔ)上，分析了不同融合肽對樹突狀細(xì)胞系DC2.4交叉遞呈的影響。本研究首次發(fā)現(xiàn)Tat-RaclC-末端肽能夠顯著增強(qiáng)DC2.4細(xì)胞的交叉遞呈。 其次，為了進(jìn)一步證實(shí)Tat-RaclC-末端肽促進(jìn)

7、DC交叉遞呈結(jié)果的可靠性，本研究首先成功誘導(dǎo)培養(yǎng)出小鼠骨髓來源樹突狀細(xì)胞(BMDC)，并從細(xì)胞的形態(tài)、得率、純度以及LPS刺激前后細(xì)胞表面分子的表達(dá)情況等幾方面對所得細(xì)胞進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明，培養(yǎng)第7天的細(xì)胞具有典型的DC形態(tài)特征，純度可達(dá)80％～90％左右，且主要為不成熟DC。隨后以E.coliBL21/pYOVA為抗原，在建立BMDC抗原交叉遞呈分析平臺的基礎(chǔ)上，分析了Tat-RatlC-末端肽對BMDC交叉遞呈的影響。結(jié)果證實(shí)，Ta

8、t-RaclC-末端肽明顯促進(jìn)BMDC的交叉遞呈，與DC2.4細(xì)胞的結(jié)果一致。 最后，本研究利用熒光顯微鏡和流式細(xì)胞術(shù)從DC的吞噬及成熟兩方面對Tat-RaclC-末端肽促進(jìn)DC交叉遞呈的機(jī)制進(jìn)行了初步探討。首先以E.coliBL21/pYOVA為抗原觀察Tat-RaclC-末端肽負(fù)載DC吞噬能力的改變。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Tat-RaclC-末端肽顯著增強(qiáng)DC對細(xì)菌抗原的吞噬，提示Tat-RaclC-末端肽對DC抗原交叉遞呈的促進(jìn)作用部

9、分是由于增強(qiáng)DC的抗原攝取能力所致。進(jìn)而，本研究進(jìn)一步分析了Tat-RaclC-末端肽增強(qiáng)DC抗原攝取能力的可能機(jī)制。以FITC標(biāo)記的轉(zhuǎn)鐵蛋白、OVA、IgG抗體調(diào)理的大腸桿菌及葡聚糖四種熒光標(biāo)記物為抗原，觀察Tat-RaclC-末端肽負(fù)載DC抗原攝取能力的改變。結(jié)果表明，Tat-RaclC-末端肽并不影響DC對上述四種抗原的攝取，提示Tat-RaclC-末端肽增強(qiáng)DC的抗原攝取能力并不依賴于轉(zhuǎn)鐵蛋白受體介導(dǎo)的內(nèi)吞、甘露糖受體介導(dǎo)的內(nèi)吞

10、、Fc段受體介導(dǎo)的吞噬以及巨吞飲這四條途徑。隨后，以表達(dá)OVA1-386蛋白的大腸桿菌為抗原，通過檢測Tat-RaclC-末端肽負(fù)載DC表面分子的表達(dá)水平分析其對DC成熟的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Tat-RaclC-末端肽不影響DC的成熟，提示該融合肽并不是通過促進(jìn)DC的成熟而增強(qiáng)DC交叉遞呈。 綜上所述，本研究通過觀察Tat穿膜肽和Rho家族不同成員C-末端多堿基區(qū)構(gòu)成的融合肽對樹突狀細(xì)胞系DC2.4交叉遞呈的影響，首次發(fā)現(xiàn)Tat-R

11、aclC-末端肽能夠顯著增強(qiáng)DC的交叉遞呈，并在小鼠骨髓來源樹突狀細(xì)胞中得到證實(shí)。進(jìn)一步分析Tat-RaclC-末端肽促進(jìn)DC交叉遞呈的機(jī)制，發(fā)現(xiàn)Tat-RaclC-末端肽明顯增強(qiáng)DC對細(xì)菌抗原的吞噬，說明Tat-RaclC-末端肽對DC抗原交叉遞呈的促進(jìn)作用部分是由于增強(qiáng)DC的抗原攝取能力所致，而與DC的成熟無關(guān)。DC抗原攝取能力的促進(jìn)作用可能是通過補(bǔ)體受體介導(dǎo)的吞噬或網(wǎng)格蛋白非依賴的內(nèi)吞途徑來實(shí)現(xiàn)的，而并不依賴于轉(zhuǎn)鐵蛋白受體介導(dǎo)的內(nèi)