丁酸鹽對骨髓源樹突狀細(xì)胞的調(diào)控及機制研究.pdf

1、目的：
　　在人和動物的腸道內(nèi)，丁酸鹽（butyrate acid，Bu）作為最主要的短鏈脂肪酸（short chain fatty acids，SCFA）之一，是由食物中不消化的碳水化合物在腸腔內(nèi)經(jīng)厭氧菌酵解生成，與腸道內(nèi)微生物群共同形成腸道區(qū)域微環(huán)境，并且參與腸道免疫穩(wěn)態(tài)的維護。到目前為止，有關(guān) SCFA調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的分化、功能及機制方面尚缺乏研究，因此本研究觀察了 Bu對免疫系統(tǒng)的重要參與者-骨髓源樹突狀細(xì)胞和體外誘導(dǎo)性粘膜

2、樹突狀細(xì)胞的調(diào)控作用。
　　方法：
　　1.丁酸鹽對小鼠骨髓源樹突狀細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用
　?。?）取骨髓細(xì)胞，破紅，計數(shù)，鋪入6孔板。
　?。?）培養(yǎng)至第七天，計數(shù)，鋪入24孔板，LPS刺激其成熟及Bu處理，觀察形態(tài)。
　?。?）流式檢測骨髓源樹突狀細(xì)胞（bone marrow derived dendritic cells, BMDCs）表面CD80、CD86、MHC-Ⅱ及B7-DC的表達(dá)情況。
　

3、?。?）Q-PCR檢測BMDCs的IL-6、IL-12的mRNA水平表達(dá)情況。
　?。?）格里斯反應(yīng)（Griess reaction）檢測細(xì)胞上清中NO的濃度。
　?。?）流式檢測BMDCs誘導(dǎo)CD8+T細(xì)胞增殖的能力。
　?。?）提蛋白，Westernblot檢測 Bu處理各時間點(0min、15min、30min、60min) BMDCs中p-ERK的表達(dá)。
　　2.丁酸鹽對RA誘導(dǎo)的小鼠骨髓源粘膜樹突狀細(xì)胞

4、分化及功能的影響
　　（1）取骨髓細(xì)胞，破紅，計數(shù)，鋪入6孔板。
　?。?）培養(yǎng)至第七天，第3天時加維甲酸（retinoic acid, RA）和丁酸鹽（Bu）處理，第七天時計數(shù)，鋪入24孔板， LPS刺激其成熟，觀察形態(tài)。
　?。?）流式檢測CD11b+CD11c+DC群體數(shù)。
　　（4）熒光示蹤染料CFSE標(biāo)記后培養(yǎng)至第七天，流式檢測FSC、SSC及CFSE的變化。
　?。?）流式檢測CCR9、α4β7

5、、CD103及CD80、CD86、MHC-Ⅱ、B7-DC的表達(dá)情況。
　?。?）流式檢測細(xì)胞醛脫氫酶(Aldehydedehydrogenase, ALDH)的活性。
　?。?）Q-PCR檢測細(xì)胞的IL-6、IL-12、TNF-α及Nos2的mRNA水平； ELISA檢測上清中IL-12p70的含量。
　　（8）流式檢測各組DCs誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞增殖的能力。
　　（9）流式檢測各組DCs誘導(dǎo)Foxp3+Treg

6、的能力。
　　結(jié)果：
　?。?）丁酸鹽可明顯下調(diào)成熟 BMDCs表面 CD80、CD86、MHC-Ⅱ及 B7-DC的表達(dá)，抑制細(xì)胞因子IL-6、IL-12及NO的分泌，并且抑制BMDCs對OVA257-264抗原特異性CD8+T細(xì)胞的增殖。Westernblot檢測結(jié)果也顯示丁酸鹽抑制 TLR4信號通路中ERK分子的磷酸化。
　?。?）丁酸鹽會顯著下調(diào)粘膜 DCs誘導(dǎo)過程中CD11c的表達(dá)，上調(diào)粘膜 DCs表面 CCR

7、9、α4β7及CD103的表達(dá)，抑制粘膜DCs細(xì)胞ALDH的活性。經(jīng)RA誘導(dǎo)的骨髓源粘膜 DCs或是正常誘導(dǎo)的BMDCs其誘導(dǎo) CD4+T細(xì)胞增殖的能力均會受到丁酸鹽的抑制，且正常誘導(dǎo)的BMDC所受的抑制更明顯。另外，RA誘導(dǎo)的骨髓源粘膜DCs更能促進誘導(dǎo)Tregs的分化，而丁酸鹽對其的抑制效應(yīng)并不明顯。
　　結(jié)論：對于BMDCs細(xì)胞，丁酸鹽可通過抑制TLR4信號通路中ERK分子磷酸化來下調(diào)BMDCs細(xì)胞的免疫功能；對于 RA誘導(dǎo)

8、的粘膜 DCs細(xì)胞，丁酸鹽可下調(diào)其 CD11c的表達(dá)且抑制其 ALDH活性，而明顯上調(diào)其腸道歸巢受體及 CD103的表達(dá)來促進其向腸道的歸巢，由此可見丁酸鹽在粘膜 DCs細(xì)胞回歸腸道定居中起重要作用；丁酸鹽對粘膜DCs誘導(dǎo)的抗原特異性T細(xì)胞增殖的抑制表明其可使T細(xì)胞呈現(xiàn)應(yīng)答低反應(yīng)性狀態(tài)，對維持腸道免疫耐受發(fā)揮的重大作用；另外，RA對骨髓源 DCs的誘導(dǎo)處理可明顯上調(diào) Tregs的分化，然而丁酸鹽的處理對粘膜 DCs這一功能的影響并不明顯