Rac2負(fù)性調(diào)節(jié)樹突狀細(xì)胞的交叉遞呈.pdf

1、樹突狀細(xì)胞(dendriticcells，DC)是主要的一種抗原遞呈細(xì)胞，目前認(rèn)為DC細(xì)胞抗原遞呈的方式有三種：一種是DC細(xì)胞吞噬外來抗原，并加工處理形成表位肽，與MHCⅡ類分子結(jié)合，從而激活CD4+T細(xì)胞；另外一種指DC細(xì)胞將內(nèi)源性合成的蛋白處理與MHCⅠ類分子結(jié)合激活CD8+T細(xì)胞；Bevan提出了一種新的DC細(xì)胞遞呈抗原的方式--交叉遞呈(crosspresentation)，它是指抗原遞呈細(xì)胞將外源性的抗原加工處理，負(fù)載到MHC

2、Ⅰ類分子表面形成復(fù)合物，從而激活初始CD8+T細(xì)胞引起細(xì)胞免疫反應(yīng)的過程。交叉遞呈對(duì)于監(jiān)視組織中的腫瘤以及清除那些不能感染抗原遞呈細(xì)胞的病毒起著十分重要的作用。詳細(xì)了解DC細(xì)胞交叉遞呈的機(jī)制將有助于我們更好的找到抗腫瘤和抗病毒的途徑，為腫瘤和病毒感染的免疫治療提供新的線索。但是目前對(duì)于DC細(xì)胞交叉遞呈的調(diào)節(jié)機(jī)制研究甚少。 以往許多研究均表明RhoGTPase參與調(diào)節(jié)DC細(xì)胞生理活動(dòng)的許多方面，包括細(xì)胞形態(tài)的重塑，樹突的伸展，抗原

3、的吞噬以及T細(xì)胞的活化。Cdc42和Rac1影響DC細(xì)胞對(duì)外來抗原的吞噬能力，其中Cdc42的活化對(duì)于DC細(xì)胞成熟過程中吞噬能力的變化起著重要作用；RhoB影響LPS刺激后DC細(xì)胞表面MHCⅡ分子的表達(dá)；另外，Rac1抑制性突變體的轉(zhuǎn)基因小鼠DC細(xì)胞吞噬凋亡細(xì)胞的能力下降，從而影響交叉遞呈。所以我們希望了解Rho家族蛋白在交叉遞呈中扮演什么樣的角色，是什么樣的機(jī)制參與其中? 目的：本研究希望通過一系列的實(shí)驗(yàn)篩選出對(duì)交叉遞呈有作用

4、的Rho蛋白分子并進(jìn)一步探討可能的機(jī)制。 方法： 1、利用：RNAi干擾的方法篩選常見的六種Rho分子：RNAi篩選的方法有利于我們將不同的分子進(jìn)行水平比較，并且為了解不同細(xì)胞的生物學(xué)功能提供線索。利用合成的siRNA，本研究分別干擾DC細(xì)胞中六種常見的Rho分子，然后利用T細(xì)胞雜交瘤B3Z檢測(cè)干擾后DC細(xì)胞交叉遞呈的能力；并且通過實(shí)時(shí)定量PCR的方法驗(yàn)證了RNA干擾的效率； 2、表達(dá)Rac2不同性質(zhì)突變體的DC

5、細(xì)胞交叉遞呈能力分析：根據(jù)Rho分子的特性，活化型突變體和抑制型突變體常常作為研究Rho分子功能的有效手段。利用點(diǎn)突變的方法，本研究構(gòu)建了Rac2的兩種突變體--活化型突變體Rac2Q61L和抑制型突變體Rac2D57N，并且與黃色熒光蛋白EYFP融合表達(dá)；通過慢病毒載體高效感染樹突狀細(xì)胞，得到穩(wěn)定表達(dá)EYFP-Rac2突變體的DC2.4，然后通過ELISA檢測(cè)表達(dá)不同突變體的DC細(xì)胞交叉遞呈的能力； 3、分子機(jī)制探討：

6、 (1)吞噬過程中Rac2的活化：熒光共振能量轉(zhuǎn)移(ForsterResonanceEnergyTransfer,FRET)是目前研究?jī)傻鞍追肿又g相互作用的最有效的手段。相對(duì)于共聚焦顯微鏡，它不但表明兩分子之間空間距離的相近，更能從功能方面闡明兩分子之間的關(guān)系。由于Rac2活化后可以與下游的PAK分子相互作用，本研究利用慢病毒載體，將DC細(xì)胞同時(shí)轉(zhuǎn)染黃色熒光蛋白標(biāo)記的Rac2以及紅色熒光蛋白標(biāo)記的PAK分子，利用激光共聚焦顯微鏡觀察在

7、吞噬外來抗原的過程中Rac2分子的活化情況以及在細(xì)胞中的定位； (2)吞噬實(shí)驗(yàn)：利用表達(dá)不同Rac2突變體的DC細(xì)胞，觀察轉(zhuǎn)染不同突變體的DC細(xì)胞對(duì)外來的表達(dá)紅色熒光蛋白的細(xì)菌抗原在不同時(shí)相的吞噬能力，了解Rac2分子對(duì)吞噬功能的影響； (3)內(nèi)源性遞呈實(shí)驗(yàn)：這種DC細(xì)胞可以內(nèi)源性表達(dá)OVA蛋白，有效地將表位肽與MHCⅠ類分子復(fù)合物遞呈到DC細(xì)胞表面，然后用表達(dá)EYFP-Rac2突變體的慢病毒感染DC-OVA細(xì)胞，觀察R

8、ac2對(duì)DC-OVA細(xì)胞內(nèi)源性遞呈的影響，說明Rac2分子在DC細(xì)胞交叉遞呈中影響環(huán)節(jié)； 4、Cd11c-EYFP-Rac2Q61L轉(zhuǎn)基因小鼠的建立：為了深入探討和觀察Rac2分子對(duì)DC細(xì)胞的功能影響，我們通過能在DC細(xì)胞中特異性表達(dá)EYFP-Rac2Q61L的慢病毒載體來感染小鼠胚胎細(xì)胞，得到了Cd11c-EYFP-Rac2Q61L轉(zhuǎn)基因小鼠，該實(shí)驗(yàn)平臺(tái)的建立為我們研究交叉遞呈相關(guān)分子提供了有效的手段，從而便于我們可以從在體水

9、平檢測(cè)該分子對(duì)交叉遞呈能力的影響。 結(jié)論：通過本研究，我們觀察到：(1)不同的Rho分子對(duì)DC細(xì)胞交叉遞呈的能力有所不同，干擾Rac2表達(dá)的DC細(xì)胞交叉遞呈能力明顯上升；(2)通過構(gòu)建慢病毒載體表達(dá)活化型和抑制型Rac2突變體，并將其轉(zhuǎn)染DC細(xì)胞，我們發(fā)現(xiàn)過度表達(dá)活化型突變體Rac2Q61L可以有效降低DC細(xì)胞的交叉遞呈；(3)在吞噬外來抗原的過程中，Rac2的活化發(fā)生在吞噬外來抗原的胞膜部分，活化下游PAK分子；(4)Rac2