樹突狀細(xì)胞內(nèi)源性遞呈途徑相關(guān)Rab分子的鑒定研究.pdf

1、樹突狀細(xì)胞(dendritic cell，DC)是目前所知的體內(nèi)功能最強(qiáng)的專職抗原遞呈細(xì)胞。通過(guò)MHlC Ⅰ類內(nèi)源性抗原遞呈途徑，它不僅能夠遞呈病毒抗原，有效活化初始性CD8+T細(xì)胞，啟動(dòng)抗病毒免疫，同時(shí)此過(guò)程也是機(jī)體誘導(dǎo)自身抗原外周及中樞耐受的重要機(jī)制。 關(guān)于內(nèi)源性抗原遞呈途徑的研究數(shù)據(jù)大多來(lái)源于B細(xì)胞，目前認(rèn)為內(nèi)源性表達(dá)蛋白在胞漿生成后，可被蛋白酶體消化降解成8-10個(gè)氨基酸的多肽，經(jīng)抗原加工相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)體(TAP)轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入內(nèi)質(zhì)

2、網(wǎng)(endoplasmic reticulum，ER)，在眾多分子伴侶如鈣聯(lián)蛋白(calnexin)、鈣網(wǎng)蛋白(calreticulin)、tapasin等的幫助下，與新生成的MHC Ⅰ類分子形成穩(wěn)定復(fù)合物，通過(guò)高爾基體轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞膜，遞呈給CD8<'+>T細(xì)胞。此過(guò)程可視為一個(gè)連續(xù)囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程，而關(guān)于此過(guò)程涉及的囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制，我們現(xiàn)在還所知甚少。 細(xì)胞內(nèi)膜性結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程包括：囊泡的形成，囊泡的移動(dòng)，囊泡與靶膜的拴縛(tethe

3、ring)。近來(lái)細(xì)胞生物學(xué)研究表明，此生物學(xué)過(guò)程受到Rab蛋白家族及其效應(yīng)分子的調(diào)節(jié)，并且不同Rab蛋白高度局限性地定位在各種囊泡的膜表面，故可被用于描述特定的內(nèi)吞體系和特定的轉(zhuǎn)運(yùn)途徑。例如：Rab4可作為早期內(nèi)吞體的標(biāo)志，Rab5調(diào)節(jié)籠形蛋白(clathrin)衣被小泡在質(zhì)膜和早期內(nèi)吞體間的轉(zhuǎn)運(yùn)，Rab7則與晚期內(nèi)吞體的形成、轉(zhuǎn)運(yùn)密切相關(guān)。因此，Rab分子可以作為“路標(biāo)”來(lái)描述抗原呈遞途徑中的復(fù)雜轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程。同時(shí)，國(guó)外及我室相關(guān)實(shí)驗(yàn)提示

4、某些Rab蛋白與抗原遞呈相關(guān)，故進(jìn)一步鑒定與DC內(nèi)源抗原遞呈囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的Rab蛋白，研究這些Rab蛋白與DC內(nèi)源抗原遞呈的相關(guān)性具有重要意義，可為理解DC內(nèi)源抗原遞呈的分子調(diào)節(jié)機(jī)制奠定基礎(chǔ)。 近年大規(guī)模siRNA干擾技術(shù)的進(jìn)展，為系統(tǒng)性研究與DC內(nèi)源性抗原遞呈相關(guān)的Rab蛋白提供了可能。本研究利用基于慢病毒的siRNA干擾技術(shù)，構(gòu)建了針對(duì)57個(gè)Rab家族蛋白的siRNA慢病毒庫(kù)。在建立的DC內(nèi)源性抗原遞呈檢測(cè)系統(tǒng)基礎(chǔ)上，發(fā)展了

5、大規(guī)模篩選策略，從而觀察干擾Rab家族蛋白表達(dá)對(duì)DC內(nèi)源性抗原遞呈的影響。結(jié)果顯示一些Rab分子(Rab1B，Rab4A，Rab5B，Rab5C，Rab8A，Rab9，Rab11A，Rab19，Rab24)與：DC內(nèi)源遞呈相關(guān)。結(jié)合這些Rab分子的特殊胞內(nèi)定位特征，我們認(rèn)為：(1)干擾Rab1B、Rab8A，Rab24這些控制胞內(nèi)物質(zhì)由高爾基體往胞膜上轉(zhuǎn)運(yùn)的Rab蛋白，能夠抑制DC細(xì)胞的內(nèi)源抗原遞呈，這與經(jīng)典的內(nèi)源性抗原遞呈理論一致；(

6、2)Rab4A，Rab5B，Rab5C，Rab11A主要是控制早期內(nèi)吞體與胞膜間轉(zhuǎn)運(yùn)的Rab蛋白，Rab9則主要與晚期內(nèi)吞體的轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)，干擾它們的表達(dá)抑制DC細(xì)胞的內(nèi)源抗原遞呈，提示DC的內(nèi)源遞呈途徑可能存在經(jīng)典途徑以外的其他途徑。(3)Rab19蛋白功能目前研究并不清楚，可能在DC內(nèi)源抗原遞呈中也發(fā)揮一定作用。以上結(jié)果為進(jìn)一步解釋DC內(nèi)源抗原遞呈可能機(jī)制及Rab蛋白功能奠定了重要基礎(chǔ)。 基于以上研究，我們推測(cè)DC細(xì)胞可能存在區(qū)

7、別于經(jīng)典內(nèi)源性抗原遞呈的其他途徑，并與早期內(nèi)吞體相關(guān)。據(jù)此我們選擇與早期內(nèi)吞體回運(yùn)相關(guān)的Rab4蛋白進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證siRNA干擾庫(kù)篩選的結(jié)果。 為證實(shí)上述推測(cè)，我們首先采用化學(xué)合成siRNA轉(zhuǎn)染DC-OVA細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)瞬時(shí)下調(diào)Rab4基因表達(dá)對(duì)DC內(nèi)源抗原遞呈的抑制作用更為明顯，并且轉(zhuǎn)染細(xì)胞表面Kb分子也有一定程度下調(diào)。隨后，我們構(gòu)建了Rab4野生型，活化型和抑制型突變體的慢病毒表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染DC-OVA細(xì)胞后，抗原遞呈檢測(cè)結(jié)果顯

8、示其抑制型的突變體可明顯抑制DC內(nèi)源性抗原遞呈，而活性突變體及野生型蛋白則對(duì)DC內(nèi)源性抗原遞呈具有促進(jìn)作用。同時(shí)，我們采用共聚焦顯微鏡觀察突變體蛋白在細(xì)胞中的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Rab4蛋白主要分布在細(xì)胞胞膜周圍的囊泡結(jié)構(gòu)中，而對(duì)照蛋白則呈彌散表達(dá)，野生型和活化型突變體Rab4Q67L主要聚集在胞膜下囊泡中，抑制型突變體Rab4S22N則主要聚集表達(dá)在核周囊泡中。這些結(jié)果與庫(kù)篩選的結(jié)果一致，并且說(shuō)明Rab4主要通過(guò)其活性的變化和定位改變參

9、與內(nèi)源性抗原遞呈的調(diào)節(jié)。 Rab4蛋白作為早期內(nèi)吞體的標(biāo)志，與Rab5B，Rab5C，Rab11A一起調(diào)節(jié)早期內(nèi)吞體與質(zhì)膜之間的轉(zhuǎn)運(yùn)，它們對(duì)于DC內(nèi)源性抗原遞呈的影響提示，DC內(nèi)源性抗原遞呈胞內(nèi)囊泡的轉(zhuǎn)運(yùn)可能與早期內(nèi)吞體有關(guān)，因此可能與外源抗原的交叉遞呈具有共同途徑，而Rab蛋白很可能因此在DC內(nèi)源性抗原遞呈與外源抗原的交叉遞呈的調(diào)節(jié)中，起著關(guān)鍵性作用，為今后調(diào)節(jié)抗原遞呈從而有效激活腫瘤或感染中細(xì)胞免疫應(yīng)答提供了靶標(biāo)。