USP22通過Wnt-β-catenin信號通路調節(jié)胰腺導管腺癌中FoxM1表達以及對上皮間質轉化的調控機制研究.pdf

1、目的：90％以上的胰腺惡性腫瘤為起源于腺管上皮的胰腺導管腺癌(pancreatic ductaladenocarcinoma，PDA)，其惡性程度高，預后極差，早期即可發(fā)生淋巴道、大血管及遠處器官轉移，確診時多數(shù)患者已達中晚期，喪失了最佳的手術治療時機。至今仍缺乏可靠的早期診斷標志物和有效的治療方法。
　　USP22(ubiquitin-specific protease22)是一種泛素特異肽酶，屬于去泛素化酶DUBs家族，是hS

2、AGA復合物的一個亞單位，參與細胞周期的調控，并能夠激活BMI-1、MYC、FBP1等介導的靶基因轉錄，在細胞周期調控、胚胎發(fā)育及端粒動態(tài)平衡等過程中發(fā)揮關鍵作用，被認為是腫瘤干細胞的標志物之一。目前已發(fā)現(xiàn)USP22的異常高表達與多種實體瘤的轉移潛能、和預后密切相關，但且其與胰腺導管腺癌的關系尚未見報道。
　　惡性腫瘤的侵襲和轉移是導致患者治療失敗、預后不佳甚至死亡的最主要因素。最近的研究表明，上皮細胞-間質轉化（epitheli

3、al-mesenchymal transition，EMT）與胰腺導管腺癌的侵襲轉移密切相關。EMT的發(fā)生使腫瘤細胞獲得了向周圍組織浸潤和侵入鄰近脈管系統(tǒng)的能力，并最終轉移到其他的組織或器官形成轉移灶。同時，通過對大樣本的胰腺癌病理組織切片進行免疫組化分析發(fā)現(xiàn)，EMT的發(fā)生與胰腺癌的不良預后顯著相關。但目前關于USP22的研究多集中在其調控細胞周期的作用上，而USP22異常表達促進腫瘤侵襲轉移的潛在機制尚未見報道。
　　本文旨在揭

4、示USP22與胰腺導管腺癌臨床預后的相關性，并初步闡明其在胰腺導管腺癌發(fā)生發(fā)展中的機制，為胰腺癌的早期診斷及靶向治療提供新的思路。
　　方法：
　　1、收集2002至2013年在大連醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院及大連醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院病理科存檔石蠟組標本且臨床資料完整的胰腺導管腺癌患者136例及癌旁正常組織42例。采用免疫組化法測定所有病理標本中USP22、FoxM1的表達情況，并對所有病例進行隨訪。分析USP22、FoxM1以及

5、USP22/FoxM1共表達與PDA患者臨床病理特征和預后的相關性。應用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，以P＜0.05為顯著性標準。表達率的組間差異比較采用x2檢驗;預后的單因素分析采用Kaplan-Meier曲線，組間比較采用Log-Rank檢驗;預后的多因素分析采用COX回歸風險模型。
　　2、利用脂質體轉染法將重組的USP22過表達質粒或USP22干擾質粒轉染至人胰腺導管腺癌細胞系（PANC-1/CFPAC-1）中。并

6、通過G418篩選穩(wěn)定轉染USP22干擾或過表達質粒的PANC-1細胞克隆。
　　3、采用RT-PCR法檢測USP22、FoxM1的基因表達。
　　4、采用Western blot檢測USP22、FoxM1、Wnt通路相關蛋白以及EMT標志蛋白的表達。
　　5、采用間接免疫熒光方法檢測USP22、FoxM1、β-catenin、F-actin、E-Cadherin以及Ezrin的表達。
　　6、利用劃痕及trans

7、well實驗觀察和分析PANC-1細胞侵襲和轉移能力。
　　結果：
　?。ㄒ唬︰SP22、FoxM1在胰腺導管腺癌中的表達及預后相關性研究
　　1、PDA組織中USP22和FoxM1的表達顯著高于癌旁正常組織(P＜0.001)，且USP22與FoxM1的表達呈明顯的正相關(r=0.450，P＜0.001)。
　　2、配對的5例新鮮癌組織中USP22、FoxM1的表達均明顯高于癌旁正常組織。同時，低分化的PANC-

8、1細胞系中USP22、FoxM1的表達明顯高于高分化的CFPAC-1細胞系。
　　3、USP22的表達與PDA患者的淋巴結轉移(P=0.009)和TNM分期(P=0.031)顯著相關;FoxM1表達與PDA患者的組織分化(P=0.020)、淋巴結轉移(P=0.015)和TNM分期(P=0.018)顯著相關。同時，USP22/FoxM1共表達陽性與PDA患者的淋巴結轉移(P=0.011)和TNM分期(P=0.041)顯著相關。

9、>　　4、Kaplan-Meier分析顯示，PDA患者中USP22、FoxM1陽性或USP22/FoxM1共表達陽性患者的OS較陰性患者明顯縮短(log-rank P=0.033; log-rank P＜0.001;log-rank P＜0.001)（見圖2）。
　　5、單因素生存分析顯示，USP22(HR:1.944;95％ CI:0.895-2.996; P=0.034)、FoxM1(HR:1.823;95％ CI:1.369

10、-3.881; P＜0.001)、USP22/FoxM1共表達(HR:2.895;95％ CI:1.346-4.237; P＜0.001)、組織分化、淋巴結轉移及TNM分期與PDA患者的預后具有顯著的相關性。
　　6、模型A的多因素生存分析顯示，USP22(adjusted HR:1.675;95％ CI:1.008-2.146; P=0.027)、FoxM1(adjusted HR:1.732;95％ CI:1.262-2.94

11、7; P=0.032)和TNM分期可以作為PDA患者的獨立預后因素。
　　7、模型B的多因素生存分析顯示，USP22/FoxM1共表達(adjusted HR:1.328;95％ CI:1.175-1.923; P=0.029)和TNM分期可以作為PDA患者的獨立預后因素。
　　（二）USP22通過促進β-catenin核內移上調胰腺導管腺癌細胞中Wnt/β-catenin信號通路活性和FoxM1表達并誘導G1/S期轉變的機

12、制研究
　　1、在PANC-1中干擾USP22的表達會導致Wnt/β-catenin信號通路活性下降，標志蛋白Axin2、LEF-1以及下游靶蛋白C-Myc的表達下調。在CFPAC-1中上調USP22的表達會導致Wnt/β-catenin信號通路活性下降，標志蛋白Axin2、LEF-1以及下游靶蛋白c-Myc的表達下調。
　　2、PANC-1中伴隨著USP22的梯度下降，細胞核內β-catenin的表達梯度下降而細胞漿中β-

13、catenin的表達梯度上升，同時細胞核和細胞漿中FoxM1的表達均呈梯度下降;CFPAC-1中伴隨著USP22的梯度上調，細胞核內β-catenin的表達梯度上調而細胞漿中β-catenin的表達梯度下降，同時細胞核和細胞漿中FoxM1的表達均呈梯度上調。另外，PANC-1細胞系中通過β-catenin過表達質粒上調β-catenin的表達后，即使利用USP22-siRNA下調USP22的表達，細胞核及細胞漿中FoxM1的表達也未發(fā)生

14、明顯變化，同時CFPAC-1中我們利用β-catenin-siRNA干擾β-catenin的表達后即使過表達USP22，細胞核及細胞漿中FoxM1的表達也均未發(fā)生明顯變化。
　　3、我們通過在PANC-1和CFPAC-1兩個細胞系中過表達USP22或干擾FoxM1，發(fā)現(xiàn)USP22過表達后兩種細胞的增殖都受到明顯促進，而干擾FoxM1后兩細胞系的增值均受到明顯抑制。我們進一步的實驗發(fā)現(xiàn)當在兩個細胞系中干擾FoxM1的表達后，即使過表

15、達USP22，兩細胞系的細胞增殖均未見明顯變化。另外，采用流式細胞技術檢測發(fā)現(xiàn)，過表達USP22后，細胞周期中G1/S期轉變加快，G1期所占比例下降明顯，S期和G2/M期比例上升;干擾FoxM1后，細胞發(fā)生明顯的G0/G1期阻滯。但當我們干擾FoxM1的表達后，即使過表達USP22，兩細胞系的細胞周期均未見明顯改變。
　　4、過表達USP22后，兩個細胞系中p21和p27有明顯下調，并伴隨著CyclinD1、Cdk4和Cdk6表達

16、的上升;干擾FoxM1的表達后，，兩個細胞系中p21和p27有明顯上調，并伴隨著CyclinD1、Cdk4和Cdk6表達的下降，但當我們在干擾FoxM1的表達同時過表達USP22，兩細胞系G1期細胞周期相關蛋白的表達并未現(xiàn)顯著變化。
　?。ㄈ︰SP22通過FAK信號通路促進Ezrin介導的細胞骨架重構和上皮間充質轉化并誘導胰腺癌細胞侵襲轉移的機制研究
　　1、我們首先通過激光共聚焦-免疫熒光試驗檢測了Panc-usp及Pa

17、nc-uspsh中F-actin的表達發(fā)現(xiàn)，Panc-usp中出現(xiàn)大量縱向排列的細胞質肌動蛋白纖維。而在Panc-uspsh中，actin的表達呈現(xiàn)點狀，細胞質肌動蛋白纖維消失。之后我們檢測了作為細胞膜分子和細胞骨架之間的重要調節(jié)蛋白和連接蛋白的Ezrin蛋白的表達，發(fā)現(xiàn)Panc-uspsh中Ezrin的表達主要集中在細胞質。有趣的是在USP22穩(wěn)定過表達的Panc-usp細胞中，Ezrin的表達明顯向細胞膜靠攏，細胞質中幾乎消失。之后

18、的Western blot結果發(fā)現(xiàn)，雖然在PANC-1、Panc-uspsh以及Panc-usp中Ezrin的表達并沒有發(fā)生明顯變化，但是Ezrin的磷酸化水平發(fā)生了明顯改變。Panc-usp中P-Ezrin的表達6.4倍于Panc-uspsh中的表達。
　　2、我們在Panc-usp中分別轉染了control-siRNA及FAK-siRNA，結果發(fā)現(xiàn)隨著FAK表達的下降，P-FAK的表達也相應下降，同時，P-Ezrin的表達也明

19、顯下調。與此同時，我們在Panc-uspsh中分別轉染了空白質粒及FAK過表達質粒，發(fā)現(xiàn)隨著FAK表達的上調，P-FAK的表達也隨之上升，同時，P-Ezrin的表達也明顯升高。
　　3、Western blot的結果顯示Panc-usp細胞中間充質細胞標志物N-鈣粘蛋白、波形蛋白及纖維連接蛋白的表達較Panc-uspsh分別增加5.8、4.2、2.7倍，而上皮細胞分子標志E-鈣粘蛋白在Panc-usp中表達比Panc-uspsh中

20、表達減少了75.3％。對EMT相關轉錄因子的檢測發(fā)現(xiàn)，Pancnnn-usp中ZEB1和Snail的表達分別5.6倍和5.3倍于Panc-uspsh中的表達。
　　4、在Panc-usp細胞轉染FAK-siRNA后，隨著P-FAK的下調，間充質細胞標志物N-鈣粘蛋白、波形蛋白及纖維連接蛋白的表達也分別下降了63.8％、81.3％、64.5％，而上皮細胞標志物E-鈣粘蛋白的表達增加了4.2倍。EMT相關的轉錄因子ZEB1和Snail

21、的表達也隨著P-FAK的下調而分別下降了為86.2％和78.4％。而在Panc-uspsh細胞轉染FAK過表達質粒后，隨著P-FAK的上調，間充質細胞標志物N-鈣粘蛋白、波形蛋白及纖維連接蛋白的表達分別增加了5.2、1.4、3.6倍，而上皮細胞標志物E-鈣粘蛋白的表達下降87.5％。EMT相關的轉錄因子ZEB1和Snail的表達也隨著P-FAK的上調分別增加了2.8倍和3.6倍。
　　5、劃痕及transwell試驗發(fā)現(xiàn)，Panc

22、-usp細胞的遷移及侵襲能力明顯高于Panc-uspsh細胞，同時，Panc-usp中下調FAK的表達能夠明顯下調其遷移及侵襲率而Panc-uspsh中過表達FAK能夠顯著上調其遷移及侵襲率。
　　結論：
　?。ㄒ唬︰SP22、FoxM1在胰腺導管腺癌中的表達及預后相關性研究
　　1、USP22、FoxM1在PDA中的表達顯著高于正常組織，且兩者的表達呈正相關，表明二者可能起協(xié)同作用參與了PDA的發(fā)生發(fā)展過程。

23、　　2、USP22表達與PDA患者的淋巴結轉移和臨床分期相關，F(xiàn)oxM1與組織分化、淋巴結轉移和臨床分期相關，USP22/ FoxM1共表達與淋巴結轉移和臨床分期密切相關，表明二者在PDA的侵襲轉移中發(fā)揮作用。
　　3、USP22、FoxM1、USP22/FoxM1共表達均與PDA患者的臨床預后密切相關，且可作為PDA的獨立預后因子。
　?。ǘ︰SP22通過促進β-catenin核內移上調胰腺導管腺癌細胞中Wnt/β-ca

24、tenin信號通路活性和FoxM1表達并誘導G1/S期轉變的機制研究
　　1、胰腺癌細胞系中USP22的表達可影響Wnt/β-catenin通路活性。
　　2、胰腺癌細胞系中USP22通過促進β-catenin核內移上調FoxM1的表達。
　　3、胰腺癌細胞系中USP22可通過上調FoxM1表達促進G1/S期轉變和細胞增殖。
　　4、胰腺癌細胞系中USP22通過上調FoxM1影響G1期細胞周期調控蛋白的表達。

25、r>　?。ㄈ︰SP22通過FAK信號通路促進Ezrin介導的細胞骨架重構和上皮間充質轉化并誘導胰腺癌細胞侵襲轉移的機制研究
　　1、PANC-1細胞系中Ezrin蛋白重分布及磷酸化在USP22導致的細胞骨架重構中起重要作用。
　　2、PANC-1細胞系中過表達USP22可促進細胞由上皮細胞表型向間充質細胞表型轉變。
　　3、PANC-1細胞系中過表達USP22能夠促進PANC-1細胞的侵襲和轉移。
　　4、PA