轉(zhuǎn)化生長因子β1通過Wnt-β-catenin信號通路誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞SMMC-7721上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的實驗研究.pdf

1、肝細(xì)胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是目前我國臨床上較為常見的惡性腫瘤，位于常見腫瘤的第六位及腫瘤相關(guān)性死亡原因的第三位，且近年來呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢。雖然隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展和外科手術(shù)技術(shù)的不斷提高，目前大部分早期確診的肝癌患者都能夠?qū)嵭懈涡郧谐?，但是肝癌患者?年總體生存率仍然很低。其中最重要的因素是肝癌具有極強的侵襲和轉(zhuǎn)移能力，術(shù)后5年內(nèi)極易出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，很多患者在術(shù)后1-2年就會出現(xiàn)肝

2、內(nèi)或肝外復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移。所以，如何有效的控制肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移是我們治療肝癌的臨床難題。
　　腫瘤微環(huán)境包括腫瘤細(xì)胞或者間質(zhì)細(xì)胞分泌的多種細(xì)胞因子、趨化因子和生長因子，它們共同組成了腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)生長、增殖、甚至是轉(zhuǎn)移相關(guān)所必須的體內(nèi)微環(huán)境，在腫瘤發(fā)生發(fā)展和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移中都發(fā)揮著關(guān)鍵作用。轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)在肝臟等消化系統(tǒng)惡性腫瘤中發(fā)揮著復(fù)雜的調(diào)控作用，包括維持腫瘤干細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)，促進(jìn)肝纖維化進(jìn)程，作為腫瘤抑制因子參

3、與免疫調(diào)節(jié)等。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)是指機體內(nèi)的上皮細(xì)胞受某些體內(nèi)外因素刺激后向具有間質(zhì)細(xì)胞表型特征發(fā)生轉(zhuǎn)變的生物學(xué)進(jìn)程，目前廣泛認(rèn)為EMT是腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的重要方式。細(xì)胞因子作為腫瘤微環(huán)境的一種成分，也參與了多種腫瘤的發(fā)生與發(fā)展。目前文獻(xiàn)證明，包括TGF-β1在內(nèi)的細(xì)胞因子能夠以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT樣改變的方式促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移。TGF-β1作為近年來的研究熱點細(xì)胞因子，已被證明在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中起到非常重要的作用，在肝癌侵襲轉(zhuǎn)移中

4、也扮演非常重要的角色。
　　基于上述研究背景，我們推測，肝癌微環(huán)境中細(xì)胞因子TGF-β1亦可能通過促進(jìn)肝癌細(xì)胞發(fā)生EMT的方式促進(jìn)肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移。為了驗證此假說，本課題主要從以下幾個方面開展研究:1.通過體外實驗驗證TGF-β1是否能夠誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞SMMC-7721發(fā)生EMT樣改變，并且觀察其對肝癌細(xì)胞SMMC-7721體外增殖、遷移和侵襲等生物學(xué)行為的影響，探討可能的分子機制。2.針對可能的信號通路中的關(guān)鍵蛋白設(shè)計干擾載體si

5、RNA處理肝癌細(xì)胞，觀察其對TGF-β1誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞的形態(tài)學(xué)以及體外增殖、遷移和侵襲等生物學(xué)特性改變。3.采用Western blot檢測EMT相關(guān)蛋白及信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)變化，探討可能涉及的信號通路和分子機制。4.采集臨床肝癌組織標(biāo)本，采用免疫組織化學(xué)方法檢測肝癌組織中TGF-β1蛋白、信號通路關(guān)鍵蛋白以及EMT相關(guān)蛋白表達(dá)情況。5.收集肝相關(guān)肝癌患者的臨床病理學(xué)資料，對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析及統(tǒng)計學(xué)處理，獲得TGF-β1與肝癌患者臨床相關(guān)

6、指標(biāo)、EMT相關(guān)標(biāo)志物等的相關(guān)性實驗證據(jù)。
　　本課題主要分為三個部分:
　　第一部分 TGF-β1通過誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生EMT樣改變促進(jìn)肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的機制研究
　　目的:觀察并獲得TGF-β1體外誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生EMT樣改變促進(jìn)其增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為的實驗證據(jù)。
　　方法:首先將不同濃度細(xì)胞因子TGF-β1(5，10，20 ng/mL)加入到完全培養(yǎng)基中與肝癌細(xì)胞SMMC-7721共培養(yǎng)，通過光學(xué)顯微

7、鏡觀察形態(tài)學(xué)變化，MTT檢測肝癌細(xì)胞增殖指數(shù)的變化情況，細(xì)胞劃痕實驗和Transwell小室穿過實驗檢測TGF-β1對肝癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響，蛋白印跡實驗檢測TGF-β1作用前后上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)標(biāo)志物蛋白的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:不同濃度細(xì)胞因子TGF-β1(5，10，20 ng/mL)與肝癌細(xì)胞SMMC-7721分別共培養(yǎng)48 h后，肝癌細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了明顯變化，細(xì)胞間隙從緊密逐漸變得松散，細(xì)胞形態(tài)從立方形逐漸伸出觸角并向成纖

8、維細(xì)胞樣轉(zhuǎn)變，結(jié)果提示TGF-β1能夠誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生EMT樣轉(zhuǎn)變，并且呈現(xiàn)濃度依賴性。MTT結(jié)果顯示:TGF-β1能夠顯著促進(jìn)肝癌細(xì)胞SMMC-7721體外增殖，并且具有時間和劑量依賴性。細(xì)胞劃痕實驗和Transwell小室穿過實驗結(jié)果顯示:TGF-β1能夠顯著增強肝癌細(xì)胞SMMC-7721體外遷移和侵襲能力。蛋白印跡實驗檢測上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)標(biāo)志物蛋白表達(dá)情況，結(jié)果顯示:TGF-β1作用后肝癌細(xì)胞SMMC-7721上皮細(xì)胞特征性標(biāo)志物

9、E-cadherin蛋白表達(dá)呈現(xiàn)下調(diào)趨勢，與此同時間質(zhì)細(xì)胞特征性標(biāo)志物Vimentin蛋白和β-catenin蛋白表達(dá)上調(diào)，這些結(jié)果提示我們TGF-β1有可能是通過win/β-catenin信號通路促進(jìn)肝癌細(xì)胞發(fā)生EMT樣改變，從而促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲等生物學(xué)行為的改變。
　　結(jié)論:細(xì)胞因子TGF-β1能夠通過誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生EMT樣改變的方式改變肝癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲等生物學(xué)行為，并且可能是通過Wnt/β-caten

10、in信號通路發(fā)揮作用。
　　第二部分 下調(diào)表達(dá)β-catenin部分抑制TGF-β1誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞生物學(xué)特性的機制研究
　　目的:運用小干擾RNA技術(shù)下調(diào)表達(dá)β-catenin來評價Wnt/β-catenin信號通路在TGF-β1誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生生物學(xué)行為改變中的作用。
　　方法:首先通過蛋白印跡實驗驗證siRNA-β-catenin的干擾效果;肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染對照質(zhì)粒和siRNA-β-catenin后分別加入細(xì)胞因子TG

11、F-β1進(jìn)行共培養(yǎng)，再分別采用MTT、細(xì)胞劃痕實驗、Transwell實驗檢測肝癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲等生物學(xué)行為的改變;蛋白印跡實驗檢測轉(zhuǎn)染siRNA-β-catenin后加入細(xì)胞因子TGF-β1誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞中EMT相關(guān)標(biāo)志物蛋白表達(dá)變化。
　　結(jié)果:siRNA-β-catenin能夠顯著下調(diào)肝癌細(xì)胞中β-catenin蛋白的表達(dá);MTT結(jié)果顯示:siRNA-β-catenin轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞后能夠顯著抑制TGF-β1誘導(dǎo)的促進(jìn)肝

12、癌細(xì)胞增殖的作用;細(xì)胞劃痕實驗和Transwell實驗也證實轉(zhuǎn)染了siRNA-β-catenin的肝癌細(xì)胞能夠部分抵抗TGF-β1誘導(dǎo)的促進(jìn)細(xì)胞遷移和侵襲的作用;蛋白印跡實驗結(jié)果顯示siRNA-β-catenin轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞后，能夠抑制TGF-β1誘導(dǎo)的EMT樣改變，表現(xiàn)為EMT相關(guān)標(biāo)志物蛋白的表達(dá)變化。這些結(jié)果提示我們β-catenin可能是TGF-β1誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生EMT樣改變影響其增殖、遷移、侵襲等生物學(xué)行為中的關(guān)鍵蛋白。

13、>　　結(jié)論:下調(diào)肝癌細(xì)胞中β-catenin蛋白表達(dá)能夠部分抑制TGF-β1誘導(dǎo)的EMT樣改變以及相關(guān)生物學(xué)行為改變，提示β-catenin可能是TGF-β1誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生EMT樣改變中的關(guān)鍵蛋白分子。
　　第三部分 肝癌組織中TGF-β1高表達(dá)對肝癌預(yù)后預(yù)測的意義
　　目的:探討臨床肝癌患者組織樣本中TGF-β1、β-catenin和EMT相關(guān)蛋白表達(dá)水平與臨床病理學(xué)指標(biāo)的相關(guān)性。
　　方法:采用免疫組織化學(xué)法檢測

14、TGF-β1、β-catenin、E-cadherin及vimentin在62例肝癌患者組織樣本中的表達(dá)水平，然后將TGF-β1與肝癌患者的臨床病理學(xué)資料進(jìn)行相關(guān)性分析。
　　結(jié)果:TGF-β1陽性表達(dá)于肝癌細(xì)胞胞漿內(nèi)，根據(jù)免疫組化結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)顯示:62例肝癌組織樣本中48.39％(30/62)高表達(dá)TGF-β1。同時發(fā)現(xiàn)高表達(dá)TGF-β1肝癌組織樣本中同時表現(xiàn)出β-catenin高表達(dá)，E-cadherin表達(dá)降低，Viment

15、in表達(dá)增加。相關(guān)性分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)高表達(dá)TGF-β1與E-cadherin的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(4/30，13.33％)，和β-catenin和Vimentin的表達(dá)呈正相關(guān)(29/30，96.67％;27/30，90％)（表1）。根據(jù)免疫組化評分結(jié)果我們組織樣本分為高表達(dá)TGF-β1組(n=30)和低表達(dá)TGF-β1組(n=32)，TGF-β1的表達(dá)情況與肝癌患者臨床病理學(xué)指標(biāo)的相關(guān)性結(jié)果見表2。TGF-β1的高表達(dá)與腫瘤大小(P=0.000

16、)，是否有血管侵犯(P=0.014)，AFP水平(P=0.043)，腫瘤數(shù)目(P=0.008)和分化程度(P=0.007)具有顯著相關(guān)性。
　　結(jié)論:肝癌組織中高表達(dá)TGF-β1伴隨著β-catenin表達(dá)增加，E-cadherin表達(dá)降低，Vimentin表達(dá)增加，這些結(jié)果提示我們在體內(nèi)隨著TGF-β1含量的升高，肝癌細(xì)胞可能通過Wnt/β-catenin信號通路誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生EMT樣改變從而發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的潛能隨之增加，TGF

17、-β1可能成為未來臨床上進(jìn)行肝癌干預(yù)治療一個新靶點。
　　全文結(jié)論:TGF-β1能夠通過誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞SMMC-7721發(fā)生EMT樣改變的方式促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲等生物學(xué)行為，其機制可能是通過Wnt/β-catenin信號通路調(diào)控。臨床試驗進(jìn)一步證明，TGF-β1在肝癌組織中高表達(dá)，且與β-catenin信號通路蛋白以及EMT標(biāo)志物相關(guān)蛋白存在相關(guān)性。TGF-β1表達(dá)水平與腫瘤大小、腫瘤數(shù)目、AFP水平、分化程度以及是否有血