在體去細胞腎臟生物支架制備的研究.pdf

1、研究背景和目的:
　　成功的器官移植術(shù)是目前治療后期器官功能衰竭的最行之有效的方法，但就當今現(xiàn)狀而言，此術(shù)對供體的需求要遠大于現(xiàn)有供體的數(shù)量，特別是在文化、習俗相對傳統(tǒng)的亞洲國家，由于器官捐獻制度和理念的差別，中國、韓國、泰國及其他東南亞國家的器官移植手術(shù)因為供體數(shù)量的制約而受到很大的限制。很多的患者由于在最后的日子里，沒能等到合適的供體來進行器官移植從而失去寶貴的生命。在如此殘酷的現(xiàn)實下，患者急需科研工作者發(fā)現(xiàn)新的組織工程學方法

2、或者依據(jù)再生醫(yī)學的策略支持研究生物人工器官來替代原有器官的功能，或者也可把細胞移植作為器官移植的補充選項，但大多數(shù)細胞的正常生長和增殖都離不開特定的、適宜的微環(huán)境和三維支持結(jié)構(gòu)。因而依靠組織工程學方法接近并達到這些條件是解決終末期器官功能衰竭的必然途徑。
　　組織工程學方法的最主要的意義是運用各種條件、物質(zhì)，重建組織或者器官，并以此種組織或器官在形態(tài)、結(jié)構(gòu)、生理和功能上替代已經(jīng)衰竭或受損嚴重的相應(yīng)器官，重新發(fā)揮正常人體的器官功能。

3、組織器官工程學的研究范圍一般涉及至少三個最為基本的部分:①具有組織特異性的細胞;②相應(yīng)器官的支架材料，又可細分為生物和非生物材料;③適合細胞生長成為目的性組織的微環(huán)境。隨著細胞來源、增殖、分化等方面地深入研究，各種不同組織特異性細胞都能在體外獲得并培養(yǎng)。而多種細胞在體外培養(yǎng)中通過去分化或者上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化在幾天內(nèi)失去它們的形態(tài)和功能。這也側(cè)面證明了微環(huán)境對維持細胞功能起著非常重要的作用。細胞外基質(zhì)(ECM)不僅僅給組織特異性的細胞提供可依

4、附的支架，也可調(diào)節(jié)它們的黏附、浸潤、遷移能力，影響其生長、分化、增殖和存活，甚至可誘導(dǎo)、改變不同細胞間的相互作用。目前在血管、膀胱以及氣管等組織的工程化已經(jīng)取得非常成功的進步。但是，對大器官如心臟、肺、腎臟以及肝臟等整個器官來說，器官重建必須要求在移植后血液能迅速支持，這就需要重建或保持廣泛的血管網(wǎng)絡(luò)來運送營養(yǎng)物質(zhì)和進行氣體交換，使移植后的組織工程化的器官能得到營養(yǎng)供應(yīng)和氧分支持。
　　然而，僅僅延續(xù)過往的浸泡法，將薄層的細胞組織

5、浸入到不同的液體中制備去細胞器官支架是不夠的。浸泡法是指通過酶或去污劑浸泡、滲透以溶解、洗脫細胞，主要利用的是組織間的滲透作用進行去細胞化，對于結(jié)構(gòu)相對簡單一點的組織如神經(jīng)，瓣膜，血管，肌腱，真皮，小腸粘膜下層等組織均可以達到理想的脫細胞效果。而對于三維結(jié)構(gòu)更加精細復(fù)雜的臟器，僅利用組織的滲透作用很難達到對器官每個局部均勻脫去細胞的作用。與浸泡法不同的是，灌注法常利用器官內(nèi)在的天然脈管系統(tǒng)為通路，使化學去污劑迅速到達器官的各個部位，在脫

6、去其細胞成分的同時，保留形態(tài)完好、結(jié)構(gòu)完整的均質(zhì)狀細胞外基質(zhì)。此外，在整個去細胞過程中及時引流出去多余、廢棄的灌注液，可減少對自身沒有脈管系統(tǒng)的部分組織去細胞化的作用的效果，避免化學去污劑破壞原有結(jié)構(gòu)?？偠灾?，灌注法是在自然原始的脈管基礎(chǔ)上，通過使用合適的化學去污劑將整個器官的所有細胞成分有效脫去，只留下蛋白成分豐富的細胞外基質(zhì)。我們可以明顯的發(fā)現(xiàn)其去細胞的效率與效果均高于以往的表面漂洗、浸泡等作用方法，并打破了以往只能制備輕、薄組織

7、和空腔臟器細胞外基質(zhì)的限制，將去細胞作用范圍擴展至各個實質(zhì)性臟器，使越來越多的學者開始關(guān)注實質(zhì)性臟器去細胞生物支架制備的方法改良和再生研究。而將以往制備離體器官生物支架的觀念向在體制備轉(zhuǎn)移，也是一種突破。器官支架離體制備法脫離了機體獨特的生理環(huán)境，往往需要進行懸掛、捆綁等操作，容易受重力、外力等因素的作用，進而容易損傷到器官的形態(tài)特點、空間結(jié)構(gòu)和生物機械功能。相反，在體制備器官支架時，實驗者都參考實驗動物的生理血流灌注情況，選擇相似或相

8、近的灌注方向、流速，保證整個實驗過程符合器官的生理學特性。在今后的研究中，相信也會有更多的學者重視通過灌注法在體制備器官去細胞生物支架。當然，在這一方法中也還存在許多的問題，比如，不同的臟器由于其結(jié)構(gòu)、功能的差異，該怎樣選擇合適的去污劑，怎樣選擇合適的流速，怎樣選擇合適的溫度等。
　　腎臟去細胞化的研究著眼于通過化學去污劑灌注器官而獲得組織特異性的細胞外基質(zhì)，使整體器官生物支架的制備成為可能。整體腎臟器官去細胞支架維持了整體的血管

9、網(wǎng)絡(luò)床，這些血管網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)不僅為目標類型的細胞通過傳統(tǒng)路徑再植提供可能，也為再植的細胞提供了三維的生長環(huán)境，而薄層的去細胞化組織只能提供二維的生長空間。故而，本研究將著重探討完整實質(zhì)器官——腎臟生物支架材料的在體制備及相容性鑒定的研究。
　　方法：
　　1.制備去細胞全腎生物支架
　　從大鼠腎血管平面以下的腹主動脈處插管作為灌注入口，分離并剪開腎血管平面以下的腔靜脈作為液體排出口，依次灌注0.05％肝素PBS溶液500m

10、l、1％TritonX-100溶液1000ml、1％SDS溶液1000ml后切取雙側(cè)腎臟。
　　2.病理學觀察
　　①肉眼觀察腎臟大體顏色、形態(tài)的改變。
　?、贖E染色、Masson三色、糖原(PAS)染色后，光鏡下觀察腎組織微結(jié)構(gòu)。透射電鏡(TEM)下觀察腎組織的超微結(jié)構(gòu)。
　　3.免疫熒光染色
　　組織石蠟包埋，切片厚約4 um-6 um。脫蠟水化處理后，加第一抗體(collagenIV抗體、LN抗體、

11、FN抗體、HSPG2抗體、Elastin抗體)孵育過夜，次日加第二抗體羊抗兔IgG（PE標記）。隨后，DAPI染液復(fù)染后觀察。
　　4.腎組織DNA含量分析
　　提取等量腎組織所含的全部基因組DNA進行定量分析，一份樣本通過紫外分光光度計測定吸光度，另外一份則做瓊脂糖凝膠電泳。
　　5.皮下植入實驗
　　切開大鼠脊背中線兩側(cè)皮膚全層至肌層，完全分離皮下組織，制備近似支架大小的皮下囊，植入去細胞腎臟生物支架組織材料

12、，再定時觀察手術(shù)切口及支架埋藏部位的組織有無紅腫、感染的跡象。
　　結(jié)果：
　　1.大體觀察
　　在整個灌注過程中，腎內(nèi)細胞從邊緣向中心處逐漸脫去，細胞碎片也逐漸被沖洗干凈，最終可見被血液充盈的雙側(cè)紅褐色腎臟最終變成無色半透明狀，腎門處可見腎動脈的重要分支。
　　2.病理學觀察
　　HE染色、Masson三色、糖原(PAS)染色及透射電鏡均顯示多個形態(tài)類似腎小球、腎小管輪廓的完整網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，且纖維連續(xù)分布，基

13、膜連續(xù)完整。
　　3.免疫熒光染色觀察
　　免疫熒光技術(shù)結(jié)合DAPI染色后，表明去細胞過程中細胞外基質(zhì)(ECM)中的重要結(jié)構(gòu)蛋白collagen IV、層粘連蛋白(LN)、纖維連接蛋白(FN)、硫酸乙酰肝素蛋白多糖2(HSPG2)、彈性蛋白(Elastin)都較好的得到了留存，而細胞膜逐漸破裂，細胞核在化學去污劑灌注的過程中逐漸減少，直致完全消失。
　　4.組織DNA含量分析
　　最終留存的去細胞腎臟生物支架中組

14、織的DNA含量為4.90 ng/mg，遠遠低于國際規(guī)定的去細胞支架的最低標準。
　　5.皮下植入實驗
　　手術(shù)初期炎癥反應(yīng)較重，傷口紅腫。隨后，炎癥反應(yīng)逐漸減輕，支架內(nèi)逐漸有毛細血管發(fā)生、出芽、生長，基質(zhì)也逐漸降解、消失。
　　結(jié)論：
　　本實驗通過大鼠在體依次灌注不同類型化學去污劑TritonX-100、SDS溶液法成功制備了雙側(cè)全腎去細胞生物支架(DKM)，并通過多個驗證實驗對支架制備過程中的關(guān)鍵步驟、關(guān)鍵試