去細(xì)胞豬角膜基質(zhì)載體支架的制備及其在組織工程人角膜基質(zhì)體外重建中的應(yīng)用研究.pdf

1、人角膜基質(zhì)約占全角膜厚度的90％,主要成分為人角膜基質(zhì)細(xì)胞、膠原纖維及蛋白聚糖,在結(jié)構(gòu)上由200-250層膠原纖維板層平行排列而成,且處于半脫水狀態(tài),在維持角膜透明及允許光線穿過中具有不可替代的作用。角膜基質(zhì)缺損所致疾病具有患病率高、致盲性強(qiáng)和臨床治療困難等特點(diǎn),在我國400余萬、全世界5500余萬角膜盲患者中,多數(shù)患者均為角膜基質(zhì)缺損性疾病所致盲。目前,這類疾病只能通過角膜移植術(shù)來治療,但由于捐獻(xiàn)角膜數(shù)量的極其有限,絕大多數(shù)患者因得不

2、到供體角膜而無法復(fù)明。體外重建的組織工程人角膜基質(zhì)可以作為人角膜基質(zhì)的等效替代物,使角膜基質(zhì)異常性疾病的臨床移植和治療成為可能,是從根本上解決供體角膜高度匱乏問題和讓眾多角膜基質(zhì)異常患者重見光明的唯一希望,也是決定完整組織工程人角膜能否體外重建成功的關(guān)鍵。為了探討利用去細(xì)胞豬角膜基質(zhì)體外重建組織工程人角膜基質(zhì)的可行性,本文通過建立去細(xì)胞豬角膜基質(zhì)的制備技術(shù),并以業(yè)已建立的非轉(zhuǎn)染、無致瘤性人角膜基質(zhì)細(xì)胞系細(xì)胞為種子細(xì)胞、以所制備的去細(xì)胞豬

3、角膜基質(zhì)為載體支架,進(jìn)行組織工程人角膜基質(zhì)的體外重建研究,為利用人角膜基質(zhì)細(xì)胞和去細(xì)胞豬角膜基質(zhì)規(guī)?；w外重建組織工程人角膜基質(zhì)奠定基礎(chǔ)。
　　 本文采用反復(fù)凍融和0.25％胰蛋白酶-0.02％EDTA(1:1)混合液消化技術(shù)對新鮮豬角膜進(jìn)行了脫細(xì)胞處理,經(jīng)冷凍干燥后制備出了完全脫去細(xì)胞的豬角膜基質(zhì)。石蠟切片的HE染色結(jié)果顯示,去細(xì)胞豬角膜基質(zhì)中的原有細(xì)胞已被完全去除,僅保留了前彈力層、后彈力層與完整的基質(zhì)板層結(jié)構(gòu),基質(zhì)層中具有

4、去除細(xì)胞后殘留下的多孔狀空隙。為了使去細(xì)胞豬角膜基質(zhì)的厚度與正常人角膜基質(zhì)一致,本文又采用Ⅰ型膠原酶消化法對去細(xì)胞豬角膜基質(zhì)進(jìn)行了薄化處理。角膜測厚儀測定結(jié)果顯示,消化處理后去細(xì)胞豬角膜基質(zhì)的厚度470μm,正常人角膜基質(zhì)的厚度相似,可以用于組織工程人角膜基質(zhì)體外重建的載體支架。
　　 為了探討去細(xì)胞豬角膜基質(zhì)應(yīng)用于組織工程人角膜基質(zhì)體外重建的可行性,本文利用非轉(zhuǎn)染、無致瘤性人角膜基質(zhì)細(xì)胞系細(xì)胞對去細(xì)胞豬角膜基質(zhì)進(jìn)行了生物相容性

5、研究。將薄化處理的去細(xì)胞豬角膜基質(zhì)平鋪于24孔培養(yǎng)板培養(yǎng)孔的底部,置37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中干貼處理48 h后備用。同時,利用25 cm2培養(yǎng)瓶將非轉(zhuǎn)染、無致瘤性人角膜基質(zhì)細(xì)胞系細(xì)胞培養(yǎng)于含10％胎牛血清(FBS)的Dulbecco's Modified Eagle's Medium／Ham's Nutrient Mixture F12(DMEM／F12,1:1)培養(yǎng)液中,培養(yǎng)到對數(shù)期后利用胰酶消化和離心法收獲細(xì)胞,懸浮于10％FBS

6、-DMEM／F12培養(yǎng)液中,細(xì)胞計數(shù)后將細(xì)胞密度調(diào)整至5×105個／mL,向預(yù)貼有去細(xì)胞豬角膜基質(zhì)的24孔培養(yǎng)板孔中接種1 mL上述細(xì)胞懸液,放置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行體外培養(yǎng)。光鏡觀察結(jié)果顯示,接種后2天,細(xì)胞數(shù)量逐漸增多；接種3 d后,去細(xì)胞豬角膜基質(zhì)上人角膜基質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)依然為成纖維樣,沉積細(xì)胞數(shù)量較多；接種4 d后,去細(xì)胞豬角膜基質(zhì)上沉積的細(xì)胞數(shù)量開始減少；而接種后第9天觀察,細(xì)胞在去細(xì)胞豬角膜內(nèi)形成了均勻的多層結(jié)構(gòu)；

7、石蠟切片蘇木精-伊紅(HE)染色結(jié)果顯示,將人角膜基質(zhì)細(xì)胞接種于去細(xì)胞豬角膜基質(zhì)上體外培養(yǎng)4d后,細(xì)胞從接種的方向遷入載體支架內(nèi),而體外培養(yǎng)養(yǎng)9d后,細(xì)胞已均勻分布于載體支架內(nèi),該結(jié)果表明,人角膜基質(zhì)細(xì)胞經(jīng)過體外培養(yǎng)能遷入到去細(xì)胞豬角膜基質(zhì)中,形成了近似活體角膜基質(zhì)的形態(tài)結(jié)構(gòu)；掃描電鏡結(jié)果顯示,體外重建的組織工程人角膜基質(zhì)細(xì)胞絕大多數(shù)仍保持角膜基質(zhì)細(xì)胞的原有形態(tài),與在體角膜基質(zhì)細(xì)胞一樣呈纖維樣,角膜基質(zhì)細(xì)胞狀態(tài)良好。上述結(jié)果表明,薄化處

8、理的去細(xì)胞豬角膜基質(zhì)與人角膜基質(zhì)細(xì)胞具有理想的生物相容性,可以用作組織工程人角膜基質(zhì)體外重建的載體支架。
　　 利用胰酶消化和離心法收獲對數(shù)期非轉(zhuǎn)染、無致瘤性人角膜基質(zhì)細(xì)胞,經(jīng)20μg／mL的DiI熒光染料標(biāo)記處N20 min后,懸浮于10％FBS-DMEM／F12培養(yǎng)液中進(jìn)行細(xì)胞計數(shù),調(diào)整細(xì)胞密度至5×105個／mL,按1 mL／孔的量將細(xì)胞接種到預(yù)貼有薄化處理去細(xì)胞豬角膜基質(zhì)的24孔培養(yǎng)板孔中,置37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)

9、行組織工程人角膜基質(zhì)的體外重建。光鏡觀察結(jié)果顯示,接種2小時后,角膜基質(zhì)細(xì)胞即粘附在豬基質(zhì)面,第9天即在脫細(xì)胞豬角膜基質(zhì)支架內(nèi)形成均勻分布的結(jié)構(gòu)。組織工程人角膜基質(zhì)石蠟切片的HE染色結(jié)果顯示,人角膜基質(zhì)細(xì)胞遷入載體支架內(nèi),均勻分布在去細(xì)胞豬角膜基質(zhì)中,形成與在體結(jié)構(gòu)相似的形態(tài)結(jié)構(gòu)；對第9天體外重建組織工程人角膜基質(zhì)的免疫熒光檢測結(jié)果顯示,接種在載體支架上的組織工程人角膜基質(zhì)細(xì)胞仍具有角膜基質(zhì)細(xì)胞特異性的標(biāo)志蛋白-波形絲蛋白；對接種后第9

10、天體外重建的組織工程人角膜基質(zhì)的掃描電鏡觀察結(jié)果顯示,組織工程人角膜基質(zhì)的種子細(xì)胞絕大多數(shù)仍保持有角膜基質(zhì)細(xì)胞的原有形態(tài),與在體角膜基質(zhì)細(xì)胞一致,且細(xì)胞嵌入在膠原纖維形成的孔內(nèi),貼附于膠原纖維生長。上述結(jié)果表明,種子細(xì)胞在載體支架中生長時仍保持有角膜基質(zhì)細(xì)胞的屬性,能形成與在體形態(tài)相似的基質(zhì)細(xì)胞均勻分布在膠原板層間的結(jié)構(gòu)。
　　 綜上所述,本文利用新鮮豬角膜成功制備出了去細(xì)胞豬角膜基質(zhì),經(jīng)薄化處理后與人角膜基質(zhì)細(xì)胞具有理想的生物