LIGHT信號分子在再生障礙性貧血中的作用.pdf

1、再生障礙性貧血(AA)是由多種病因、多種發(fā)病機理引起的骨髓造血功能衰竭、造血細胞數(shù)量減少所引發(fā)的，以貧血、出血和感染為主要癥狀的一組異質(zhì)性疾病。再障發(fā)病機理較為復雜，以往認為再障的發(fā)生與造血干細胞損傷、造血微環(huán)境缺陷及免疫介導有關，三種機制在不同的患者個體中單獨或聯(lián)合作用，導致造血功能衰竭。近年來越來越多的學者認識到細胞免疫功能紊亂在再障發(fā)病中起著重要作用，已成為再障基礎研究方面一個最活躍的領域。
　　近年來的研究已發(fā)現(xiàn)AA患者不

2、僅存在T細胞數(shù)量的異常，其功能和表型也有明顯改變。新近的研究則進一步證實，AA患者體內(nèi)不但淋巴細胞異?；罨?，淋巴細胞極化明顯異常，Th1表型細胞比例顯著增多，尤其產(chǎn)生的負性造血調(diào)控因子如γ-干擾素和腫瘤壞死因子-α含量升高。在AA小鼠動物模型的研究中也同樣證實其體內(nèi)存在異?；罨牧馨图毎?，使用ATG、CSA及抗IFN-γ或抗TNF-α單抗治療有效，同時發(fā)現(xiàn)該類小鼠造血功能衰竭主要與Fas介導的造血干/祖細胞凋亡有關，并由此提出獲得性再生

3、障礙性貧血是由T細胞介導的器官特異性細胞毒T細胞針對自身CD34+造血干/祖細胞的一種自身免疫性疾病。因此，繼續(xù)深入探討免疫學發(fā)病機理具有重要的理論意義和實用價值。
　　共刺激分子LIGHT、HVEM是一對近年來研究比較多的共刺激分子，LIGHT與HVEM結合后可促進T細胞活化、增殖、產(chǎn)生細胞因子及發(fā)揮相應的生物學效應。LIGHT/HVEM信號在細胞免疫應答過程中具有重要作用，是一個免疫治療的靶分子。
　　最近的研究發(fā)現(xiàn)LI

4、GHT信號與一些自身免疫性疾病相關，主要包括關節(jié)炎、動脈粥樣硬化、腸炎。轉(zhuǎn)基因小鼠研究表明LIGHT在T細胞上表達會導致淋巴細胞活化，炎癥反應，集中在腸粘膜組織的組織損傷。相對地，破壞LTβ/LIGHT信號轉(zhuǎn)導在自身免疫性疾病動物模型中被證實可減輕炎癥反應，LIGHT基因的敲除可以阻止一些T細胞介導的疾病的進展，如胰島素依賴型糖尿病，炎癥性腸病，急性自身腦脊髓膜炎，GVHD。
　　我們利用Peromyscus leucopus.l

5、inville(PLL)成功建立免疫介導的再生障礙性貧血動物模型，利用再生障礙性貧血模型進行LIGHT表達的測定，并應用LIGHT單抗取得了再生障礙性貧血治療的顯著療效，利用RNA干擾技術，下調(diào)LIGHT基因表達，使再障發(fā)病進程得到改善。同樣的現(xiàn)象我們在再障患者中得到了驗證，我們通過提取再障患者的外周血淋巴細胞，觀察LIGHT的表達，均發(fā)現(xiàn)再障治療前后，LIGHT表達有明顯的差異。所以我們的實驗主要探討了LIGHT信號分子在再生障礙性貧

6、血發(fā)生過程中的作用，并且我們有理由相信LIGHT在再障發(fā)病進程中起著重要作用。
　　一.peromyscus leucopus的生物學特性，及其在造血系統(tǒng)疾病研究中的作用
　　Peromyscus leucopus，是一種有著白色爪子的鼠，是北美地區(qū)最常見的野生鼠種群。它和我們常見的實驗用鼠MMB6從體型及外貌都非常相似。它是人類很多疾病的傳播者。最新對于Peromyscus.leucopus的研究興趣是因為認為這物種可能是

7、研究血液系統(tǒng)疾病的理想動物模型，
　　目的:研究Peromyscus leucopus的生物學特性，了解其外周血象，骨髓象，病理特點，及利用此動物進行再生障礙性貧血模型建立的研究，以探索其在血液系統(tǒng)疾病研究中的作用，
　　方法:參照文獻方法，將Peromyscus leucopus(PLL)小鼠分成三組，2-6月為年輕組，7-15月為中年組，＞15月為老年組。分別進行血常規(guī)、骨髓細胞、脾臟細胞計數(shù)，以及骨髓、肺、脾臟、肝臟的

8、病理檢測，予NAC干預后，檢測ROS表達。分離正常父系PLL的淋巴細胞，調(diào)整細胞數(shù)為20-50×106/L，先接受5GyTBI，從尾靜脈注射入F1代小鼠，通過血常規(guī)、骨髓檢測，以證實再生障礙性貧血動物模型的建立。
　　結果:我們檢測了全血細胞計數(shù)，骨髓細胞和脾臟細胞計數(shù)，骨髓、脾臟、肝臟和肺臟的病理和外周血流式細胞檢測。我們發(fā)現(xiàn)Peromyscus.leucopus外周血有更低的血小板計數(shù)，更接近于人類血小板值，骨髓中更少的巨核細

9、胞，這可能更適合用于研究人類血小板減少疾病。老年組表現(xiàn)為血紅蛋白(Hb)、紅細胞壓積(Hct)下降，但血小板會增加，這點與年齡相關的血象變化，同人類血液變化相似。骨髓細胞和脾臟細胞計數(shù)較MMB6明顯減低，脾臟重量也顯著小于MMB6，鼠源抗體CD3、CD4、CD8、CD44和CD45R可適用于PLL。PLL的淋巴細胞適用N—乙?！狶—半胱氨酸(NAC)證實PLL良好的抗氧化效應。通過血常規(guī)、骨髓象證實，成功建立了免疫介導的再生障礙性貧血模

10、型。
　　結論:PLL的生物學特征更接近于人類，尤其是血象表現(xiàn)接近與人類，今后可以將其作為研究血液疾病更好的動物模型。
　　二.LIGHT表達及變化與再生障礙性貧血發(fā)生發(fā)展間關系的研究
　　目的:研究LIGHT信號分子在再生障礙性貧血模型中的表達，及LIGHT單抗在模型中的治療作用。體外阻斷LIGHT的表達，觀察再障發(fā)病進程的改變。
　　方法:將實驗動物分三組，一組對照組，小鼠接受5Gy全身照射(TBI)，第二組

11、TBI+淋巴細胞輸注組（模型組），實驗小鼠接受5GyTBI，并輸注5×106/L父系淋巴細胞。第三組TBI+淋巴細胞+LIGHT單抗，實驗小鼠接受5GyTBI，予當天接受5×106/L父系淋巴細胞輸注，并于輸注后d1、2、3、4、5連續(xù)接受100ul/dLIGHT單抗輸注，于第14天進行骨髓細胞計數(shù)，骨髓、肝臟、脾臟、腸道等病理檢測。將父系淋巴細胞進行LIGHT基因的RNA干擾，再回輸給F1代小鼠，通過外周血象及骨髓象的改變，觀察再生障

12、礙性貧血發(fā)病進程的改變。
　　結果:TBI+淋巴細胞輸注組白細胞(WBC)、中性粒細胞下降明顯，淋巴細胞比例明顯增高，輸注LIGHT單抗后中性粒細胞、淋巴細胞回升，血小板上升。骨髓細胞行流式細胞檢測，發(fā)現(xiàn)代表T細胞活化的CD3+比例在淋巴細胞輸注組明顯升高，CD3+CD8+比例相較對照組明顯升高，LIGHT表達在再障組亦升高，造血干細胞表達在淋巴細胞輸注組顯著降低，而LIGHT組造血干細胞出現(xiàn)明顯的回升。接受父系淋巴細胞后，干擾組

13、的血象同正常值相比無明顯變化，模型組血象明顯下降，以白細胞、淋巴細胞、血小板下降最明顯，骨髓病理比較，干擾組造血細胞可見，骨髓增生活躍，而模型組骨髓增生低下，巨核細胞減少，脂肪細胞易見。
　　結論:LIGHT信號分子在再障發(fā)病過程中起著重要作用，隨著LIGHT單抗的應用和特異性阻斷LIGHT，均發(fā)現(xiàn)再障的血象及骨髓象有所恢復。
　　三，再生障礙性貧血患者LIGHT分子表達的變化
　　目的:檢測正常成人、重型再生障礙性貧

14、血、非重型再生障礙性貧血患者外周血LIGHT的表達，及再障患者經(jīng)免疫抑制治療前后LIGHT的對比，觀擦LIGHT的改變同再障療效的關系。
　　方法:留取我院血液內(nèi)科自2011年4月至2012年2月間確診的再生障礙性貧血患者，共10例，收集再生障礙性貧血外周血，分離獲得淋巴細胞，流式檢測淋巴細胞上LIGHT的表達，提取正常對照、重型再障治療前，經(jīng)ATG治療后3月外周血T淋巴細胞總mRNA，檢測活化T細胞LIGHT分子基因表達。

15、>　　結果:重型再障外周血LIGHT分子表達明顯高于正常對照，非重型再障，重型再障為25.4±3.4％，非重型再障患者為16.4±4.7％，而正常對照僅為5.8±1.6％。重型再障患者LIGHT mRNA明顯高于正常組，在治療后3月，出現(xiàn)LIGHT信號分子的明顯下調(diào)，血象出現(xiàn)恢復跡象。
　　結論:LIGHT表達上調(diào)與再生障礙性貧血的發(fā)生存在相關性，通過再障患者治療前后LIGHT信號分子表達的改變，可以確定LIGHT信號分子在再障發(fā)