解凍的新鮮冰凍血漿復蘇失血性休克與血管保護機制研究.pdf

1、失血性休克(Hemorrhagic shock，HS)是軍民和居民戰(zhàn)(創(chuàng))傷死亡的主要原因。在臨床治療過程中，與傳統(tǒng)復蘇液乳酸林格氏液(lactated ringer，LR)相比，新鮮冰凍血漿(fresh frozen plasma，F(xiàn)FP)因其在復蘇病員中提高患者生存率，具有一定的優(yōu)勢，被臨床創(chuàng)傷救治廣泛采用。而一氧化氮(nitric oxide，NO)是介導內皮細胞功能重要分子，我們設想FFP復蘇失血性休克的療效可能得益于誘導NO分

2、泌和舒張血管。為了探討FFP復蘇作用分子機制，本文采用NO/Nitrite/Nitrate分析法首先檢測了HS大鼠模型FFP及LR復蘇后不同時間點血清中NO含量，結果發(fā)現(xiàn)FFP復蘇后HS大鼠血清中NO含量顯著增加(p<0.05)。與單獨HS組大鼠相比，F(xiàn)FP復蘇組HS大鼠血清中NO含量增加幅度大，出現(xiàn)時間早(p<0.05)，而LR復蘇卻降低大鼠HS復蘇后各時間檢測點NO含量。同樣對體外培養(yǎng)人肺正常微血管內皮細胞(HPMECs)和人真皮淋

3、巴管內皮細胞(HDLECs)FFP處理后NO含量進行分析，結果FFP處理后血管內皮細胞NO生成同樣增加，與對照組相比統(tǒng)計學有顯著性差異(p<0.05)。為了探討FFP復蘇對HS大鼠血管舒張功能的影響，隨后測定各組大鼠乙酰膽堿誘導內皮依賴性血管舒張反應，與單獨HS組相比，結果發(fā)現(xiàn)FFP復蘇顯著增加乙酰膽堿誘發(fā)內皮依賴性血管舒張反應(分別是49+4mmHg與37±4 mmHg)(p<0.05)。進一步探討：FFP誘導內皮細胞NO分泌分子機制

4、，采用磷酸化蛋白激酶抗體芯片和免疫印跡方法篩選和鑒定FFP處理后內皮細胞相關蛋白激酶磷酸化，結果發(fā)現(xiàn)為FFP顯著增加兩株內皮細胞12種蛋白激酶磷酸化，且在兩株內皮細胞中FFP均能誘導.AMPKα1，Akt1和eNOS磷酸化。FFP誘導eNOS磷酸化在FFP復蘇HS大鼠的肺組織中同樣得到了證實。表明FFP體內外均能激活AMPKα1/Aktl/eNOS信號轉導通路。分別采用Compound C(AMPK的抑制劑)，LY294002(PI3K

5、/Akt抑制劑)或L-NAME(NOS抑制劑)預處理HPMECs細胞，阻擋AMPKα1/Akt1/eNOS信號轉導通路，結果為上述三種抑制劑均能抑制FFP誘導eNOS激活和NO生成，提示AMPKeα1/Akt1/eNOS信號轉導通路激活介導FFP誘導NO分泌和血管舒張。
　　 本項目首次報道FFP誘導增加HS大鼠血清和體外培養(yǎng)內皮細胞上清NO含量，并進一步篩選和鑒定出.AMPKα1/Akt1/eNOS信號轉導通路介導FFP誘導N

6、O分泌和血管舒張，揭示了FFP復蘇保護血管內皮細胞新機制。為了進一步探討FFP誘導血管內皮細胞增加NO抑制HS誘導血管收縮改善微循環(huán)及修復內皮細胞功能提供科學依據(jù)。
　　 失血性休克是創(chuàng)傷后死亡的首要原因。最近的臨床研究表明，盡早、盡快地采用新鮮冰凍血漿(fresh frozen plasma，F(xiàn)FP)進行復蘇能顯著改善臨床失血性休克復蘇效果。為了滿足各地救治中心對FFP日益增長的需求及快速便捷獲得FFP，經批準新鮮解凍血漿4℃

7、貯存不多于5天仍可用臨床復蘇。研究報道FFP中含有高濃度與內皮細胞遷移有關的轉化生長因子-β(transform growth factor-β，TGF-β)。由此我們設想FFP可能促進內皮細胞遷移，貯存的FFP可能改變了生長因子水平和信號轉導，從而降低FFP療效。本項目以遷移力作為功能研究著眼點，比較新鮮解凍血漿(FFe Day0)和4℃貯存5天FFP(FFP Day5)在正常氧供和缺氧條件下誘導內皮細胞遷移能力及其對內皮細胞TGF-

8、β信號轉導通路影響以及FFP貯存過程中TGF-β濃度變化。FFP(Day0)和FFP(Day5)分別處理人肺微血管內皮細胞(Human pulmonary microvascular endothelial cells，HPMECs)和人真皮淋巴管內皮細胞(human dermal lymphatic endothelial cells，HDLECs)后，行遷移實驗和Western印跡分析，結果發(fā)現(xiàn)：1)在正常供氧和缺氧條件下，F(xiàn)FP(

9、Day0)和FFP(Day5)均能促進細胞遷移，而FFP(Day5)促進細胞遷移能力顯著下降(p<0.05)；2)FFP(Day0)與FFP(Day5)相比，TGF-β1水平顯著升高(p<0.05)；3)抑制TGF-βI型受體ALK5的活性后，增強FFP(Day0)和FFP(Day5)誘導內皮細胞遷移能力；4)FFP處理后顯著增加TGF-β信號轉導通路關鍵分子Smad2/3磷酸化，預處理ALK5活性可抑制其磷酸化。在體外培養(yǎng)兩株內皮細胞

10、中，F(xiàn)FP(Day5)誘導增加Smad2/3磷酸化幅度大，與FFP(Day0)相比，具有顯著性差異(p<0.05)。結果表明TGF-β1/ALK5/Smad2/3信號轉導通路參與抑制FFP誘導內皮細胞遷移，標準貯存導致TGF-β1水平升高和增加TGF-β1/ALK5/Smad2/3信號通路轉導進而削弱FFP促進內皮細胞遷移。
　　 本項目首次報道FFP不管是在正常供氧還是在缺氧條件下均能誘導內皮細胞遷移，貯存將增加細胞因子TGF