脂聯(lián)素在糖尿病腎病中的保護(hù)作用及相關(guān)機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、糖尿病腎病(Diabetic Nephropathy, DN)是糖尿病常見(jiàn)又嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，它是以腎小球系膜細(xì)胞增生，細(xì)胞外基質(zhì)增多，腎小球基底膜增厚等病理生理改變及腎小球硬化為主要特征的病變。其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，與腎小球血流動(dòng)力學(xué)改變、生化代謝紊亂，氧化應(yīng)激，細(xì)胞因子、遺傳易感性等多種因素有關(guān)。DN預(yù)后差，相比其它原因所致的腎臟疾病更難以治療，其原因尚不清楚。研究表明，細(xì)胞因子分泌增多，細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)蛋白代謝異常在DN發(fā)病機(jī)制的各

2、個(gè)環(huán)節(jié)起著重要作用，其中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)是一個(gè)重要的細(xì)胞因子，它的異常表達(dá)在ECM代謝過(guò)程中發(fā)揮重要的作用，可直接或間接促進(jìn)ECM成分增加，是導(dǎo)致糖尿病患者腎臟纖維化的最后共同中介物質(zhì)。此外，近來(lái)越來(lái)越多的證據(jù)表明，氧化應(yīng)激(oxidativestress,OS)在糖尿病腎病發(fā)病中起重要作用；糖尿病狀態(tài)下由于活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)的產(chǎn)生增多和/或清除減少導(dǎo)致了氧化應(yīng)激狀態(tài)。R

3、OS本身可攻擊脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA，導(dǎo)致腎臟損害。
　　 脂聯(lián)素(adiponectin,ADPN)是一種由白色脂肪組織分泌的蛋白產(chǎn)物，是脂肪組織在人血漿分泌最多的蛋白。脂聯(lián)素又稱(chēng)30kD脂肪細(xì)胞補(bǔ)體相關(guān)蛋白(Acrp30)或28kD膠原結(jié)合蛋白(GBP28)，人類(lèi)脂聯(lián)素基因由apM1 mRNA編碼，位于染色體3q27上，全長(zhǎng)16Kb，由3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子組成。自從1995年發(fā)現(xiàn)脂聯(lián)素以來(lái)，多項(xiàng)研究已證實(shí)脂聯(lián)素具有抗炎、改善

4、胰島素抵抗、抗動(dòng)脈粥樣硬化、降血糖、血脂等作用，最近研究發(fā)現(xiàn)脂聯(lián)素還具有抗氧化作用。臨床研究發(fā)現(xiàn)血漿ADPN濃度與糖尿病腎病關(guān)系密切。對(duì)早期糖尿病腎病的研究顯示循環(huán)脂聯(lián)素水平與尿蛋白呈負(fù)相關(guān)，說(shuō)明早期糖尿病腎病內(nèi)皮功能受損與低脂聯(lián)素水平有關(guān)；進(jìn)展期糖尿病腎病患者尿脂聯(lián)素和血脂聯(lián)素水平增加，認(rèn)為其可能通過(guò)抗炎、抗動(dòng)脈硬化等作用，減輕腎臟損害。然而脂聯(lián)素對(duì)糖尿病腎病保護(hù)作用的機(jī)理研究甚少。因此我們?cè)隗w外將脂聯(lián)素作用于高糖誘導(dǎo)的人腎小球系膜細(xì)

5、胞，觀察其對(duì)細(xì)胞增殖、TGF-β1、活性氧簇(ROS)和內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)產(chǎn)生的影響，并對(duì)其相關(guān)信號(hào)通路進(jìn)行探討；同時(shí)構(gòu)建表達(dá)ADPN的pIRES2-EGFP-gAd熒光質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)染糖尿病大鼠模型，探討其對(duì)腎臟的保護(hù)作用與機(jī)理。本研究的目的、方法、結(jié)果、結(jié)論分三部分概述如下：
　　 第一章、脂聯(lián)素對(duì)系膜細(xì)胞氧化應(yīng)激和TGFβ1的影響及細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制研究
　　 目的：觀察脂聯(lián)素對(duì)高糖誘導(dǎo)下腎小球系膜細(xì)胞RO

6、S、eNOS以及TGF-β1產(chǎn)生的影響，并探討腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)信號(hào)通路在這一過(guò)程中的作用。
　　 方法：體外培養(yǎng)人腎小球系膜細(xì)胞(HMCs)，RT-PCR檢測(cè)HMCs脂聯(lián)素受體(adiponectin receptor,AdipoR)mRNA的表達(dá)。分別用高糖(30mM)和不同濃度(3-10ug/ml)重組人球形脂聯(lián)素蛋白干預(yù)HMCs24、36小時(shí)，MTT試驗(yàn)觀察細(xì)胞增殖情況。將細(xì)胞隨機(jī)分為4組：對(duì)照組、高糖組(3

7、0mM)、高糖＋脂聯(lián)素組和高糖＋脂聯(lián)素＋AMPK抑制劑araA(adenine9-β-D-arabinfuranoside)組，觀察脂聯(lián)素對(duì)高糖誘導(dǎo)的HMCs氧化應(yīng)激和TGF-β1 mRNA和蛋白表達(dá)的影響。熒光探針檢測(cè)ROS釋放；RT-PCR檢測(cè)eNOS和TGF-β1 mRNA表達(dá)，Western blot檢測(cè)eNOS和TGF-β1蛋白水平。另外，為了進(jìn)一步明確脂聯(lián)素上述作用的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，用脂聯(lián)素10ug/ml單獨(dú)干預(yù)系膜細(xì)胞，

8、分別于0、5、10、15、30min提取胞漿蛋白，Western blot檢測(cè)磷酸化AMPK蛋白(p-AMPK)表達(dá)。
　　 結(jié)果：1)RT-PCR證實(shí)人腎小球系膜細(xì)胞上有AdipoR1和AdipoR2表達(dá)，半定量結(jié)果示AdipoR1明顯占優(yōu)勢(shì)（AdipoR1的表達(dá)強(qiáng)度是AdipoR2的3.5倍）；2)脂聯(lián)素呈時(shí)間和劑量依賴(lài)性地抑制高糖刺激下的HMCs增殖；3)Western blot檢測(cè)p-AMPK蛋白證實(shí)脂聯(lián)素可以時(shí)間依賴(lài)的

9、方式誘導(dǎo)系膜細(xì)胞AMPK磷酸化；4)高糖組HMCs的ROS釋放量較對(duì)照組明顯增加，eNOS產(chǎn)生減少，TGF-β1表達(dá)上調(diào)(p＜0.05)；脂聯(lián)素處理后ROS產(chǎn)生量較高糖組明顯減少，eNOS表達(dá)上調(diào)，TGF-β1產(chǎn)生減少(p＜0.05)；加入AMPK抑制劑araA后，可部分抑制脂聯(lián)素的上述作用。
　　 結(jié)論：1、脂聯(lián)素能夠抑制高糖誘導(dǎo)的HMCs增生和活性氧產(chǎn)生，促進(jìn)eNOS產(chǎn)生，下調(diào)TGF-β1的表達(dá)，從而對(duì)抗高糖對(duì)系膜細(xì)胞的損傷

10、。
　　 2、脂聯(lián)素可刺激系膜細(xì)胞AMPK通道開(kāi)放，脂聯(lián)素對(duì)HMCs的保護(hù)作用部分是通過(guò)脂聯(lián)素受體介導(dǎo)AMPK信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。
　　 第二章、表達(dá)ADPN的pIRES2-EGFP-gAd質(zhì)粒載體的構(gòu)建及其在大鼠腎臟的表達(dá)
　　 目的：構(gòu)建表達(dá)脂聯(lián)素的pIRES2-EGFP-gAd質(zhì)粒，觀察其在大鼠腎臟的表達(dá)，為體內(nèi)觀察脂聯(lián)素對(duì)糖尿病大鼠模型的腎臟影響奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：根據(jù)GENBANK中人脂聯(lián)素的c

11、DNA編碼球形結(jié)構(gòu)域(gAd)的序列設(shè)計(jì)引物，以已有的pET/gAd質(zhì)粒（編碼脂聯(lián)素球形結(jié)構(gòu)域的細(xì)菌表達(dá)質(zhì)粒，gAd基因克隆于pET-15b載體的多克隆位點(diǎn)，長(zhǎng)440bp）為模板，PCR擴(kuò)增目的片段，連接T載體后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，用EcoRI和BanHI雙酶切后，與pIRES2-EGFP熒光質(zhì)粒連接，重組構(gòu)建pIRES2-EGFP-gAd質(zhì)粒。將構(gòu)建成功的pIRES2-EGFP-gAd質(zhì)粒采用脂質(zhì)體介導(dǎo)經(jīng)腹腔注射正常大鼠體內(nèi)，然后在不同時(shí)間

12、點(diǎn)(24h、48h、96h、7d)留取腎臟標(biāo)本進(jìn)行冰凍切片，在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白在腎組織中的表達(dá)情況，同時(shí)采用Western Blot檢測(cè)腎皮質(zhì)綠色熒光蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)果：1)重組構(gòu)建的pIRES2-EGFP-gAd載體經(jīng)雙酶切電泳分析及DNA測(cè)序證實(shí)無(wú)堿基突變。2)在腹腔注射脂質(zhì)體/pIRES2-EGFP-gAd轉(zhuǎn)染復(fù)合物后24h，熒光顯微鏡下觀察，即可在腎小球腎間質(zhì)檢測(cè)到綠色熒光蛋白的表達(dá)，在注射后48h熒光

13、強(qiáng)度進(jìn)一步增強(qiáng)，隨著給藥時(shí)間的延長(zhǎng)，綠色熒光蛋白在腎臟的表達(dá)逐漸減少，在注射后第7d時(shí)，雖然仍能檢測(cè)到綠色熒光蛋白的表達(dá)，但熒光強(qiáng)度明顯減弱。Western Blot檢測(cè)EGFP蛋白結(jié)果與冰凍組織切片結(jié)果一致。
　　 結(jié)論：脂質(zhì)體能夠介導(dǎo)pIRES2-EGFP-gAd真核載體在大鼠腎臟表達(dá)，實(shí)驗(yàn)中將能發(fā)出綠色熒光的EGFP報(bào)告基因融合在gAd基因的3′端，既保留了gAd的生物活性，又便于基因治療中可檢測(cè)到蛋白表達(dá)，為探討脂聯(lián)素在

14、DN中的作用提供實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷於ɑA(chǔ)。
　　 第三章、復(fù)制DM模型研究脂聯(lián)素對(duì)腎臟的保護(hù)作用及機(jī)制
　　 目的：研究脂聯(lián)素對(duì)糖尿病大鼠的腎臟保護(hù)作用及其相關(guān)機(jī)制。
　　 方法：采用高糖高脂飲食配合腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)的方法復(fù)制糖尿病大鼠模型。將32只Wistar大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組（NC組）、糖尿病組（DM組）、ADPN干擾組（DA組）和空載體轉(zhuǎn)染組(DP)，其中DA、DP組分別腹腔注射脂質(zhì)體/pIRES2

15、-EGFP-gAd或脂質(zhì)體/pIRES2-EGFP復(fù)合物。處理8周后，觀察血糖、糖化血紅蛋白(HbAlc)、24h尿微量白蛋白(UMA)變化；留取腎組織切片觀察光鏡下的病理改變并測(cè)定腎組織ROS釋放量的變化；熒光定量RT-PCR檢測(cè)各組大鼠腎組織eNOS、TGF-β1的基因轉(zhuǎn)錄水平，采用免疫組化法檢測(cè)eNOS、TGF-β1、p-AMPK蛋白的表達(dá)水平。
　　 結(jié)果：與正常對(duì)照組比較，DM模型組大鼠UMA顯著上升，腎組織ROS釋放

16、量增加(P＜0.05)，DM、DA、DP各組之間UMA無(wú)明顯差異(P＞0.05)。與DM組相比，DA組血糖和HbAlc有所下降，ROS釋放明顯減少(P＜0.05)。光鏡下DM組大鼠大部分腎小球系膜區(qū)增寬，基質(zhì)大量增生，節(jié)段性基底膜增厚、部分腎小管上皮細(xì)胞空泡變性、脫落，腎小球內(nèi)細(xì)胞數(shù)顯著增多、單個(gè)核細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，與DM組相比，脂聯(lián)素干預(yù)組以上病變均有減輕。與對(duì)照組相比DM組腎組織eNOS水平下降，TGF-β1表達(dá)明顯上調(diào)，p-AMPK蛋