血清反應(yīng)因子在糖尿病腎病上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化中的作用及相關(guān)機(jī)制.pdf

1、研究背景與研究目的:
　　糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)在糖尿病患者中的患病率大約為20％～40％，是糖尿病的重要并發(fā)癥和主要死亡原因。近年來隨著糖尿病患者人數(shù)的快速增長，DN的發(fā)病率逐年上升，在一些國家或地區(qū)已經(jīng)成為終末期腎病(ESRD)的首位原因。DN的發(fā)病機(jī)制極為復(fù)雜，其確切機(jī)制尚未明確，多種因素通過各自作用以及相互交叉作用共同導(dǎo)致DN的發(fā)生和發(fā)展。對DN發(fā)病機(jī)制更深一步的研究，將對發(fā)掘DN有效

2、的預(yù)防和治療方法產(chǎn)生深遠(yuǎn)而重要的意義。
　　足細(xì)胞是腎小球?yàn)V過膜極其重要的組成部分，其電荷屏障作用是阻止蛋白質(zhì)漏出的關(guān)鍵。DN時足細(xì)胞發(fā)生EMT，足突融合、消失，隨后發(fā)生陰離子電荷減少、微絨毛形成、體積縮小，足細(xì)胞最終從腎小球基底膜(GBM)上分離剝脫至腎小囊中，發(fā)生足細(xì)胞分離。通常認(rèn)為足細(xì)胞EMT是足細(xì)胞損傷的起始環(huán)節(jié)，可以導(dǎo)致足細(xì)胞運(yùn)動性增強(qiáng)、蛋白尿和腎小球纖維化。在EMT的過程中，足細(xì)胞標(biāo)志物synaptopodin、緊密連

3、接蛋白-1(zonula occludens，ZO-1)、P-cadherin和nephrin降低，間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物膠原蛋白-1、纖連蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)、成纖維細(xì)胞特異性蛋白-1(Fibroblast specific protein-1，F(xiàn)SP-1)以及α-平滑肌激動蛋白(α smooth muscle actin，α-SMA)升高。
　　盡管傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為DN是繼發(fā)性腎小球疾病，現(xiàn)在越來越多的證據(jù)表明腎功能損傷的

4、程度與腎小管間質(zhì)纖維化的程度更加相關(guān)，腎小管損傷在DN進(jìn)展中作用不容忽視。在腎小管上皮細(xì)胞(Renal tubular epithelial cells，TECs) EMT的過程中，上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin和ZO-1降低，間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物FN、collagen-i、α-SMA、FSP-1升高。Snail、Zeb和helix loop helix(HLH)家族都是引發(fā)EMT的重要轉(zhuǎn)錄因子，它們能夠抑制E-cadherin的表達(dá)并促

5、進(jìn)間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)。
　　血清反應(yīng)因子(serum response factor，SRF)是高度保守的順式作用因子，屬于MADS-box轉(zhuǎn)錄因子家族。與SRF結(jié)合的DNA位點(diǎn)為血清反應(yīng)元件(Serumresponse element，SRE)，存在于幾乎所有物種的基因組中，控制著細(xì)胞骨架和收縮蛋白的表達(dá)。SRF促進(jìn)中胚層細(xì)胞遷移，在胚胎體軸延長中發(fā)揮重要作用，表明SRF對胚胎發(fā)育至關(guān)重要。根據(jù)目的基因的不同，SRF可以通過兩

6、條途徑被激活（見圖1）:Ras-細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular regulated kinase，ERK)-三重復(fù)合物因子(ternary complex factors，TCFs); Rho-肌動蛋白-心肌蛋白相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(myocardin related transcription factors，MRTFs/MAL)。大量研究表明SRF在上皮腫瘤（如肝細(xì)胞癌、胃癌、前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌等）的EMT和轉(zhuǎn)移過程中

7、發(fā)揮重要作用。在轉(zhuǎn)基因小鼠，過表達(dá)的SRF可以導(dǎo)致肌細(xì)胞肥大、間質(zhì)纖維化和肌纖維損傷。相反的，SRF冠狀動脈平滑肌細(xì)胞敲除可以降低血管平滑肌細(xì)胞的遷移和增殖能力。此外，SRF促進(jìn)轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factorβ，TGF-β)介導(dǎo)的肺肌成纖維細(xì)胞分化，應(yīng)用蛋白激酶A降低SRF的表達(dá)和活性可以抑制這一作用。近期王漢民等研究表明，SRF在大鼠單側(cè)輸尿管結(jié)扎模型中可導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞EMT;SRF通過sn

8、ail信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路加重高糖透析液引起的腹膜間皮細(xì)胞EMT。
　　根據(jù)以上背景，我們提出如下假說:在高血糖情況下，大鼠腎臟中SRF和磷酸化SRF(pSRF)表達(dá)升高，并且從細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞核轉(zhuǎn)位增加，通過Snail信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路導(dǎo)致足細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞EMT，加重腎臟纖維化和蛋白尿;小分子抑制劑CCG-1423可以直接抑制SRF和pSRF的表達(dá)，減輕足細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞EMT，改善糖尿病大鼠的腎臟纖維化和蛋白尿。為了驗(yàn)證此假說，我們通

9、過1型糖尿病大鼠模型和體外培養(yǎng)永生化足細(xì)胞、近端小管上皮細(xì)胞，分別探討SRF在DN腎小球纖維化和腎小管問質(zhì)纖維化中的作用及相關(guān)機(jī)制，從而發(fā)掘DN新的治療靶點(diǎn)。
　　研究方法:
　　為了明確SRF在DN腎小球纖維化中的作用及相關(guān)機(jī)制，體外實(shí)驗(yàn)采用小鼠永生化足細(xì)胞，CCG-1423（1μM或2μ M）預(yù)處理1h后，進(jìn)行高糖刺激72h;為了探索SRF是否促進(jìn)足細(xì)胞EMT，我們采用SRF上調(diào)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染足細(xì)胞，并使用Transwell小

10、室遷移分析評估足細(xì)胞的遷移能力。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)采用一次性腹腔注射STZ(60 mg/kg BW)構(gòu)建糖尿病大鼠模型，STZ注射后每日腹腔注射CCG-1423(0.01或0.02 mg/kg BW)，持續(xù)8周。實(shí)驗(yàn)結(jié)束前對大鼠稱重并放入代謝籠收取24h尿，然后抽血、灌流、取腎，隨后檢測和計算各項(xiàng)指標(biāo)。采用western blot、實(shí)時熒光定量PCR(QPCR)和半定量PCR方法檢測小鼠足細(xì)胞和大鼠腎皮質(zhì)SRF、pSRF、synaptopodin

11、、ZO-1、collagen-1、α-SMA和FSP-1等的表達(dá);免疫熒光染色檢測足細(xì)胞中SRF的表達(dá)量和定位;實(shí)驗(yàn)室方法檢測大鼠血糖、血肌酐、血尿素氮和24h尿蛋白定量;免疫組織化學(xué)染色（免疫組化）方法檢測大鼠腎小球中SRF、P-cadherin、FN等的表達(dá);PAS染色和masson染色評估大鼠腎小球纖維化的程度。
　　為了明確SRF在DN腎小管間質(zhì)纖維化中的作用及相關(guān)機(jī)制，體外實(shí)驗(yàn)采用永生化人近端小管上皮細(xì)胞（HK-2細(xì)胞）

12、，CCG-1423(1μM or2μM)預(yù)處理1h后，進(jìn)行高糖刺激72h;為了探索SRF是否促進(jìn)HK-2細(xì)胞EMT，我們采用SRF上調(diào)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HK-2細(xì)胞，并使用Transwell小室遷移分析評估HK-2細(xì)胞的遷移能力。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)采用一次性腹腔注射STZ(60 mg/kg BW)構(gòu)建糖尿病大鼠模型，STZ注射后每日腹腔注射CCG-1423（0.01或0.02 mg/kg BW），持續(xù)8周。實(shí)驗(yàn)結(jié)束前對大鼠稱重并放入代謝籠收取24h尿，然后

13、抽血、灌流、取腎，隨后檢測和計算各項(xiàng)指標(biāo)。采用western blot和QPCR方法檢測大鼠腎髓質(zhì)和HK-2細(xì)胞SRF、pSRF、E-cadherin、ZO-1、collagen-1、α-SMA和FSP-1等的表達(dá);免疫熒光染色檢測HK-2細(xì)胞中SRF的表達(dá)量和定位;實(shí)驗(yàn)室方法檢測大鼠血糖、血肌酐、血尿素氮和24h尿蛋白定量;免疫組化方法檢測大鼠腎髓質(zhì)中SRF、E-cadherin、FN等的表達(dá);PAS染色評估大鼠腎小管間質(zhì)纖維化的程度

14、。
　　研究結(jié)果:
　　1.SRF在DN足細(xì)胞EMT中的作用及相關(guān)機(jī)制
　　1.1高糖刺激導(dǎo)致足細(xì)胞EMT和SRF表達(dá)升高
　　與正常組和甘露醇對照組相比，高糖刺激72h后，足細(xì)胞中SRF和pSRF的蛋白表達(dá)和基因表達(dá)均明顯升高，足細(xì)胞標(biāo)志物(synaptopodin、ZO-1)表達(dá)明顯下降，間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物（collagen-1，F(xiàn)N，F(xiàn)SP-1和α-SMA）表達(dá)明顯升高。免疫熒光染色顯示，高糖不僅導(dǎo)致SRF表達(dá)

15、升高，而且誘導(dǎo)SRF向足細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移。
　　1.2在足細(xì)胞中過表達(dá)SRF，導(dǎo)致EMT和腎小球?yàn)V過膜損傷
　　與轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒(pcDNA3.1)的足細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染SRF上調(diào)質(zhì)粒(pcDNA-SRF)的足細(xì)胞中synaptopodin表達(dá)下降，collagen-1、FN、FSP-1、α-SMA和Snail表達(dá)升高。在Transwell小室遷移分析中，pcDNA-SRF組遷移數(shù)量較pcDNA3.1組明顯增加。在白蛋白濾過實(shí)驗(yàn)中，p

16、cDNA-SRF組白蛋白濾過量較pcDNA3.1組明顯升高。
　　1.3 CCG-1423對高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞EMT的作用
　　與高糖組相比，經(jīng)CCG-1423預(yù)處理的足細(xì)胞SRF、pSRF和Snail的蛋白表達(dá)和基因表達(dá)均降低，synaptopodin表達(dá)升高，collagen-1、FN、FSP-1和α-SMA表達(dá)降低。免疫熒光染色顯示，CCG-1423不僅可以降低SRF的表達(dá)，而且還能抑制SRF向足細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移，從而進(jìn)一步

17、抑制SRF的作用。
　　1.4糖尿病大鼠腎皮質(zhì)中SRF的變化
　　隨著糖尿病時間的延長，大鼠腎皮質(zhì)中SRF的蛋白表達(dá)和基因表達(dá)均逐漸升高。免疫組化表明，隨著糖尿病病程的延長，腎小球中SRF的表達(dá)較正常組逐漸升高。
　　1.5 CCG-1423對糖尿病大鼠生化指標(biāo)的影響
　　與正常組相比，DM組血糖、血肌酐、血尿素氮、24h尿蛋白定量和腎重體重比升高，血清白蛋白降低，所有糖尿病大鼠造模成功。與DM組相比，CCG-1

18、423治療后的糖尿病大鼠血清白蛋白明顯升高，但是血糖、血肌酐、血尿素氮和腎重體重比沒有變化。
　　1.6 CCG-1423對糖尿病大鼠腎小球纖維化和蛋白尿的影響
　　與DM組相比，CCG-1423治療后糖尿病大鼠24h尿蛋白定量降低約50％，腎皮質(zhì)SRF、pSRF、collagen-1、FSP-1表達(dá)量明顯降低，synaptopodin表達(dá)量明顯升高。免疫組化顯示，與DM組相比，DM+CCG-1423組腎小球α-SMA和FN

19、的表達(dá)降低，P-cadherin表達(dá)升高。Masson染色和PAS染色均表明，CCG-1423可以使糖尿病大鼠的腎小球纖維化程度明顯減輕，腎小球硬化指數(shù)降低約50％。
　　2.SRF在DN腎小管上皮細(xì)胞EMT中的作用及相關(guān)機(jī)制
　　2.1高糖刺激導(dǎo)致HK-2細(xì)胞EMT和SRF表達(dá)升高
　　與正常組和甘露醇對照組相比，高糖刺激72h后，HK-2細(xì)胞中SRF和pSRF的蛋白表達(dá)和基因表達(dá)均明顯升高，上皮細(xì)胞標(biāo)志物（E-ca

20、dherin和ZO-1）表達(dá)明顯下降，間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物（collagen-1，F(xiàn)N，α-SMA和FSP-1）表達(dá)明顯升高。免疫熒光染色顯示，高糖不僅導(dǎo)致SRF表達(dá)升高，而且誘導(dǎo)SRF向HK-2細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移，從而發(fā)揮調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的作用。
　　2.2在HK-2細(xì)胞中過表達(dá)SRF導(dǎo)致EMT
　　與正常組和pcDNA3.1組相比，轉(zhuǎn)染SRF上調(diào)質(zhì)粒(pcDNA-SRF)的HK-2細(xì)胞中E-cadherin表達(dá)下降，collagen-1、F

21、N、α-SMA、FSP-1和Snail表達(dá)升高。在Transwell小室遷移分析中，pcDNA-SRF組遷移細(xì)胞數(shù)量較正常組和pcDNA3.1組明顯增加。
　　2.3 CCG-1423對高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞EMT的作用
　　與高糖組相比，經(jīng)CCG-1423預(yù)處理的HK-2細(xì)胞SRF、pSRF和Snail的蛋白表達(dá)和基因表達(dá)均降低，E-cadherin表達(dá)升高，collagen-1、FN、α-SMA和FSP-1表達(dá)降低。免疫

22、熒光染色顯示，CCG-1423不僅可以降低SRF的表達(dá)，而且還能抑制SRF向HK-2細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移，從而進(jìn)一步抑制SRF的作用。
　　2.4糖尿病大鼠生化指標(biāo)的變化
　　與正常組相比，隨著糖尿病時間的延長，大鼠血糖、血肌酐、血尿素氮、24h尿蛋白定量和腎重體重比均逐漸升高，血清白蛋白逐漸降低，實(shí)驗(yàn)組所有糖尿病大鼠造模成功。
　　2.5糖尿病大鼠腎髓質(zhì)中SRF的變化
　　隨著糖尿病時間的延長，大鼠腎髓質(zhì)中SRF的蛋白

23、表達(dá)和基因表達(dá)均逐漸升高。免疫組化表明，隨著糖尿病病程的延長，腎小管中SRF的表達(dá)較正常組逐漸升高。
　　2.6 CCG-1423對糖尿病大鼠腎小管間質(zhì)纖維化和白蛋白尿的影響
　　與DM組相比，CCG-1423治療后糖尿病大鼠腎髓質(zhì)SRF、pSRF、collagen-1、α-SMA、FSP-1和Snail表達(dá)量明顯降低，E-cadherin表達(dá)量明顯升高，24h尿白蛋白定量降低約36.4％。免疫組化顯示，與DM組相比，DM+

24、CCG-1423組腎小管FN、FSP-1和Snail表達(dá)降低，E-cadherin表達(dá)升高。PAS染色表明，CCG-1423可以使糖尿病大鼠的腎小管間質(zhì)纖維化程度明顯減輕。
　　結(jié)論:
　　1.高血糖激活大鼠腎臟中SRF，使SRF和pSRF表達(dá)升高，并且從細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞核轉(zhuǎn)移增加，通過Snail信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路導(dǎo)致足細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞EMT，導(dǎo)致蛋白尿、腎小球纖維化和腎小管間質(zhì)纖維化。
　　2.使用CCG-1423抑制SR