GalR1在慢病毒介導(dǎo)的DREAM沉默治療CCI大鼠疼痛中的作用.pdf

1、目的：甘丙肽受體1（GaIR1）屬于G蛋白偶聯(lián)受體，甘丙肽信號(hào)通路在痛覺調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。本研究探討脊髓背角甘丙肽信號(hào)通路在慢病毒介導(dǎo)的DREAM基因沉默治療CCI大鼠疼痛中的作用，以進(jìn)一步闡明DREAM調(diào)控疼痛的可能機(jī)制。 方法：選擇健康雄性SD大鼠24只，隨機(jī)分為四組（n=6）：即RNA干擾組、空白載體組、單純CCI組和正常對照組。鞘內(nèi)置管前1天，造模前1天及CCI后2、4、6、8、10、12、14天測定痛閾（包括PWTL

2、和PWMT）。RNA干擾組和空白載體組于CCI后第7天開始經(jīng)微導(dǎo)管分別注入pKCSHR-Puro/ GFP-DR-EAM慢病毒10μl+NS5μl和空白載體10μl+NS5μl，連續(xù)注射3天。于CCI后第14天，取L4-5脊髓節(jié)段，其中一部分迅速放入凍存管置于液氮罐冷凍備用，另一部分用石蠟包埋、切片，采用熒光顯微鏡下觀察GFP在大鼠脊髓背角的表達(dá)，Realtime PCR測定腰段脊髓DREAM基因、GalR1基因mRNA的表達(dá)，West

3、ern Blot測定腰段脊髓內(nèi)DREAM蛋白、GalR1蛋白的表達(dá)。 結(jié)果： 1.大鼠痛閾的變化：手術(shù)同側(cè)（左側(cè)）熱痛閾和機(jī)械痛閾測定結(jié)果：置管前1天、CCI前1天的基礎(chǔ)痛閾無差異（P>0.05）。與正常對照組相比，CCI后2天開始，RNA干擾組、空白載體組及單純CCI組的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)熱痛閾和機(jī)械痛閾均顯著降低（P<0.01）。RNA干擾組治療后較CCI后6天痛閾升高（P<0.01），而治療后同時(shí)間點(diǎn)RNA干擾組較空白載體

4、組及單純CCI組痛閾亦升高（P<0.01）。而手術(shù)對側(cè)（右側(cè)）各時(shí)間點(diǎn)痛閾值無差異（P>0.05）。 2. CCI后14天，RNA干擾組大鼠腰段脊髓背角神經(jīng)細(xì)胞可見大量綠色熒光，GFP表達(dá)陽性，提示慢病毒載體轉(zhuǎn)染成功。 3.Realtime PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果：RNA干擾組CCI后14天時(shí)脊髓背角DREAM基因mRNA的表達(dá)明顯弱于其他各組（P<0.05），其他各組間無顯著差異（P>0.05）。RNA干擾組GalR1基因mR

5、NA的表達(dá)明顯弱于空白載體組、單純CCI組（P<0.05），但高于正常對對照組（P<0.05），空白載體組和單純CCI組表達(dá)無差異（P>0.05）。 4.Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果：RNA干擾組的DREAM蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào)（P<0.05），而其他各組（空白載體+CCI組、單純CCI組、正常對照組）間DREAM蛋白表達(dá)無差異（P>0.05）。與正常對照組相比，RNA干擾組、空白載體組和單純CCI組的GalR1蛋白表達(dá)水平